咖啡因代谢产物及检测方法研究进展

咖啡因代谢产物及检测方法研究进展

咖啡因是提取自茶叶和咖啡果实中的一种碱性物质。这种纯茶是由白色和强烈苦的粉末组成的。咖啡因属甲基黄嘌呤生物碱,化学式为C8H10N4O2,化学名为1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。自从人们认识到咖啡因的用途以来,咖啡因就被人为添加到多种食品、饮料和药物中,咖啡因与人类健康息息相关,并在人们生活中占有不可替代的地位。咖啡因适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用,临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。但是,大剂量或长期使用也会对人体造成损害,特别是其成瘾性,一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状,虽然其成瘾性较弱,戒断症状也不十分严重,但由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时,咖啡因就不仅作用于大脑皮层,还能直接兴奋延髓,引起阵发性惊厥和骨骼震颤,损害肝、胃、肾等重要内脏器官,诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病,甚至导致吸食者下一代智能低下,肢体畸形,因此也被列入受国家管制的精神药品范围。一、-n-脱甲基化降解信号通路咖啡因口服后主要在胃肠道快速而完全的吸收,约在15~60分钟达峰值浓度,峰值可持续到120分钟,胃排空延迟是导致峰值变异的主要原因(Benowitz.1990)。当咖啡因由小肠进入门脉循环时,会经过首过消除效应,主要由分布在肠壁和肝脏的细胞色素P450(CYP450)酶作用,之后再进入全身大循环。因为咖啡因首过消除效应较弱,所以咖啡因经吸收后,能完全地进入全身组织并且自由通过血-脑、胎盘、血-睾屏障(Miners等.1996)。咖啡因系统平均清除率约为150ml/min,半衰期为2~4.5小时(Lelo等.1986),有的个体则长达12小时。咖啡因隔夜一般就会被肝脏代谢清除,只有不到5%的咖啡因以原形通过肾脏排泄(Devoe等.1993)。咖啡因体内代谢过程复杂,在尿液中现今已发现咖啡因15种代谢产物,参与代谢过程的酶也逐一证实。口服咖啡因后,首先经3-N-脱甲基化生成17X(副黄嘌呤),为主要代谢产物,约占80%,这一步反应由药物代谢酶CYP1A2催化(部分由CYP2E1代谢)。此外,咖啡因通过1-N-脱甲基和7-N-脱甲基分别生成37X(可可碱,12%)和13X(胆茶碱,7%),分别由药物代谢酶CYP1A2和CYP2E1催化完成;13X进一步经3-N-脱甲基化生成1X(1-甲基嘌呤);17X和1X进一步经C-8-羟基化分别生成17U和1U,这两步反应分别由CYP2A6和黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)催化完成。咖啡因及其代谢途径详见图1。17X为主要代谢产物之一,分子结构与咖啡因相近,在血尿标本中很容易被检测,几乎60%的17X是以原型从尿中排泄(Lelo等.1986,Arnaud等.1980,Klebanoff等.1998)。17X的代谢速度与其生成速度相当,相对血浆咖啡因而言,一天中17X的波动水平和变异程度较小,血浆中17X的降解速度比咖啡因要慢,通常服药后8~10小时,17X的血药浓度超过咖啡因水平(Arnaud等.1993)。另外两个主要代谢产物37X和13X在体液及脐带血中就能被检测到,它们的半衰期相对较长。37X是咖啡因的主要活性代谢产物,约50%的37X在8~12小时内由尿液排泄(Tarka等.1983)。37X药理作用包括利尿、刺激心血管系统、舒张平滑肌、增加腺体分泌(Shively等.1985)。37X的代谢主要由CYP1A2参与,几乎占86%,部分由CYP2E1完成,其半衰期为7.2~11.5小时,37X血浆和肾清除率分别为46%和67%,吸烟人群中血浆清除率一般高于非吸烟人群33%左右(Shively等.1985,Rostami-Hodjegan等.1986,Lelo等.1986,Birkett等.1985,Gates等.1999)。代谢产物13X结构与咖啡因也相近,仅少一个7-N-甲基,其药理活性相近于咖啡因和37X,但是毒性作用却强于二者,毒性作用比咖啡因持续时间长3~9小时,但是个体间变异却比较大(Stavric等.1988)。13X通过肝肾代谢清除,主要代谢酶为CYP1A2,通过3-N-去甲基化反应生成1X以及8-氢化反应生成13U。肾清除率与尿流速和流量高度相关,13X血浆浓度偏高将导致代谢清除率降低并增加肾脏清除率。13X的清除、代谢、排泄,类似于咖啡因,均存在较大的个体差异。常见外源性的影响因素包括:吸烟、病毒感染、心、肝疾患、妊娠、饮食和合并用药,这些因素均影响13X的代谢和排泄,如吸烟增加其代谢和排泄,怀孕则降低其代谢清除,可以导致13X在体内的聚积,而胎儿和新生儿缺少代谢13X的酶,完全依赖于肾脏的排泄,容易发生咖啡因中毒。二、其他ayp2a6酶在咖啡因代谢的途径中,有多种药物代谢酶参与,主要的药物代谢酶归纳如下:(一)CYP1A2CYP1A2是细胞色素P450氧化酶的一个亚家族,约占肝脏CYP450s酶含量的13%,参与咖啡因、华法林、茶碱、普萘洛尔、美西律、维拉帕米、硝苯地平、他克林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、阿米替林、氟伏沙明和氯氮平等20多种临床常用药物的代谢。CYP1A2也参与外源性物质的代谢,介导许多前致癌原或前毒性物质的体内激活,同时也代谢解毒一些有害物质。CYP1A2的活性能被吸烟、多环芳香烃及药物(如奥美拉唑、卡马西平)诱导,也可被喹诺酮类抗生素和口服避孕药抑制。CYP1A2是参与咖啡因初级代谢过程的主要代谢酶,CYP1A2催化咖啡因1-N-和7-N-脱甲基化反应,此外CYP1A2还参与了咖啡因几个次级代谢产物的生成。CYP1A2同样也参与了代谢产物17X、37X和13X的N7、N3和N1位脱甲基反应,分别生成1X、7X和3X。此外,CYP1A2还可能参与了17X、37X和13X8-羟化反应,分别生成17U、37U和13U。此外,其他药物酶如CYP2A6、2E1、3A4也在二甲基尿苷代谢产物的生成中发挥重要作用(Fuhr等.1992,Tang等.1994,Robson等.1988)。(二)CYP2A6CYP2A6是细胞色素酶P450家族中的重要成员之一,完成整个CYP450家族代谢任务的约3%。许多外源性物质包括药物(如香豆素、丙戊烷、氟烷等)、前致癌原(如亚硝胺、尼古丁、黄曲霉素B1等),以及其他一些化学物质均通过CYP2A6进行生物转化。同时,CYP2A6也是尼古丁的主要代谢酶,CYP2A6的活性与个体吸烟行为以及吸烟数量相关。CYP2A6基因突变导致CYP2A6酶活性的降低与多种肿瘤疾病存在负相关,例如肺癌、结肠癌、胰腺癌、鼻咽癌等。而影响CYP2A6酶活性的因素多种多样,年龄、性别、遗传因素、合并用药、环境等都均能对CYP2A6活性产生影响。CYP2A6参与了咖啡因代谢产物17X的羟化代谢,生成17U,因而尿中咖啡因代谢比率17U/17X可以应用于CYP2A6活性的评价,该比率增加表明CYP2A6活性增加。(三)N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase)N-乙酰转移酶参与芳香胺和肼类物质包括2-氨基芴、4-氨基联苯以及联苯胺的代谢,外源性的毒物以及临床用药包括异烟肼、氨苯砜、普鲁卡因胺、磺胺二甲基嘧啶等,因此N-乙酰化反应可以改变药物活性及降解致癌物质。在咖啡因所有开环的代谢产物中,AFMU及其降解产物AAMU在定量上均具有重要的地位,而N-乙酰转移酶是影响AFMU生成的主要代谢酶(Kilbane等.1992)。(四)黄嘌呤氧化酶(XO)XO(xanthineoxidase)参与了1X到1U的生成,这是没有争议的事实。然而不管是从137X、37X或13X来源的3X,均不代谢为3U(Krul等.1998)。(五)CYP3ACYP3A是人体最为重要的药物代谢酶,在肝和肠道中含量丰富,约占成人肝脏CYP450酶总量的25%,并且为肠道的主要CYP450酶。CYP3A有多种亚型,在成人体内主要是CYP3A4和CYP3A5。CYP3A在外源性物质,尤其是药物代谢中起重要作用,临床中约有60%的药物由其代谢转换;同时CYP3A也催化许多内源性物质,例如雌二醇、睾丸酮及可的松的6β-羟化代谢。CYP3A酶活性存在显著的个体差异性,体外人肝微粒体中CYP3A活性的个体差异达40倍,同样在小肠及肝微粒体中的差异也很大,导致个体差异的影响因素包括遗传、环境、生理、病理及饮食等多种遗传和非遗传因素。化学及免疫抑制试验结果证明,CYP3A4主要参与了137X到137U的生成代谢(Tassaneeyakul等.1992)。(六)CYP2ElCYP2E1和其他同工酶参与了137X三种脱甲基化产物17X、13X、37X的生成,其中,相对CYP1A2来说,CYP2E1在13X、37X的生成中可能起主导作用(Gu等.1992)。三、血药浓度和测定方法关于咖啡因及其代谢产物的检测,一直以来国内外都有较多的研究报道。然而根据不同的研究目的,咖啡因代谢产物的选取各不一样,有些研究关注咖啡因和几个甲基嘌呤代谢产物的检测,而另外的研究则关注黄嘌呤和尿酸代谢产物的检测。HPLC-UV/DAD法最常用于血尿标本咖啡因及其代谢产物的检测,也有HPLC-MS/MS检测方法的报道,质谱检测器灵敏度高,离子筛选能力强,特异性高,实现了高通量检测的需求,能很好的满足咖啡因及其代谢产物的同时检测及其定量要求。虽然检测仪器代代更新,逐步趋向高尖化,性能也在提高完善,但咖啡因及其代谢产物样本的前处理环节改动较少,其流程基本保持不变,可能的原因是咖啡因及其代谢产物各自的理化性质差异比较大,所以能同时满足这些物质萃取条件的要求受到了苛刻的限制。四、固相萃取法咖啡因样本前处理通常采用有机溶剂液-液萃取法,常用的萃取试剂为三氯甲烷/异丙醇混合液(90:10或85:15),三氯甲烷/异丙醇不同的比率影响着咖啡因及其代谢产物的萃取效率,而90:10或85:15的配比较为常用。液-液萃取过程中常需酸化样本,一是可以稳定样本中咖啡因的代谢产物,减少生物降解;二是酸化样本可提高待测物的萃取回收率。除了液-液萃取法外,固相萃取法也是常用的处理方法,固相萃取法节省试剂,在极性强、小分子物质及复杂物质的萃取方面有着较强的优势。但是固相萃取法的萃取柱造价高,费用贵,使用寿命短,因而消耗大,给普通实验室样本的前处理带来较大的经济压力。此外,也有直接沉淀法处理样本的报道,操作中直接往样本中加入高氯酸,震荡离心,再用适当的碱中和多余的高氯酸,然后直接进色谱分析系统分析。方法简单、快速、低廉,为咖啡因及其代谢产物的检测提供了一条经济的样本前处理方案(Holland等.1998)。此外,尿液标本也可经酸化、甲醇脱蛋白、离心除杂质,取上清进入液相色谱系统检测。值得一提的是,也有研究中采用搅拌棒吸附萃取(stirbarsorptiveextraction,SBSE)的方法,SBSE是上世纪90年代末Baltussen等发明的一种新型的样品前处理技术,具有灵敏度高、重现性好、不使用有机溶剂等优点,适用于食品、环境、生物样品中挥发性及半挥发性有机物的痕量分析。就咖啡因及其代谢产物的萃取方面而言,SBSE提取设备可以大大减少咖啡因及其代谢产物的萃取流程,实现待测物的直接提取,缩短流程、节省时间,但目前应用还未得到推广。五、cyp1a2活性众所周知,许多CYP450s酶均参与了咖啡因体内的生物转换。因为咖啡因是人类生活中广泛接触的外源物质,用咖啡因代谢指数评估体内药物代谢酶活性的研究近年来引发人们极大的兴趣。尿液中咖啡因代谢产物的比率(CMRs)常用于药物代谢酶活性的评估,包括CYP1A2、CYP2A6、N-乙酰转移酶、黄嘌呤氧化酶。咖啡因是CYP1A2经典的探药,因为几乎90%的咖啡因由CYP1A2转化代谢。血尿中咖啡因代谢比率(17U+17X)/137X、17X/137X和(AFMU+1X)/17U及(AAMU+1X+1U)/17U常用于CYP1A2活性的评价(Nakajima等.1994,Lang等.1994)。(AFMU+1X+1U)/17U这一指标不受尿流量的影响,主要建立在咖啡因代谢终产物的比率上,因而尿液标本的采集量和时间对CYP1A2活性的评价影响不大。AFMU/1X、AFMU/(AFMU+1X+1U)、(AAMU+AFMU)/(AAMU+AFMU+1X+1U)常用于NAT2的活性评价(Bendriss等.2000);17U/17X、17U/(AFMU+1X+1U+17X+17U)常用于CYP2A6活性的评价;1U/(