不同频率电刺激对大鼠丘脑底核神经元活动的影响

不同频率电刺激对大鼠丘脑底核神经元活动的影响

近年来，高频电刺激（pd）被用于改善帕金森病（pd）的运动症状，并取得了令人满意的效果。丘脑底核-深部脑刺激术(STN-DBS)已经逐渐成为PD治疗的首选方法,但其机制却尚未阐明。最近一些研究表明束旁核(PF)参与运动的调节。PF是丘脑髓板内核群后群的一组核团,与基底神经节的不同核团之间有着广泛的联系,对基底节环路发挥有效的调控功能。但高频刺激STN治疗PD的运动症状,是否有PF神经元的参与还尚未见报道。本实验用电刺激方法研究大鼠STN对PF神经元放电的影响,有助于阐明高频电刺激STN治疗PD的作用机制。1材料和方法1.1实验动物和机器成年雄性Spragne-Dawley大鼠12只,体重250～300g(辽宁医学院动物中心提供)。1.2实验方法1.2.1实验动物及放电大鼠经20%氨基甲酸乙酯(0.8mL/100g)腹腔麻醉后,置于脑立体定位仪上。行常规开颅手术,剥除硬脑膜,并行小脑延髓池引流,以降低颅内压,防止脑疝。参照Paxions&Watson′s大鼠脑图谱确定STN坐标(AP-3.8mm,LR2.2～2.8mm,H7.8～8.0mm),PF坐标(AP-4.16～-4.30mm,LR1.1～1.6mm,H4.9～6.1mm)。刺激电极以与脑平面成80°的倾斜角从右侧刺入STN内。电刺激经A320隔离刺激器(美国WPI公司),由同心圆电极输出。电刺激参数为:频率(20～200)Hz,刺激强度0.4mA,波宽0.06ms,刺激时程5s。细胞外记录采用微电极拉制仪(美国STOELTING公司)自行拉制的单管玻璃微电极。电极尖端直径<2μm,电阻5～15MΩ,管内灌注含1%滂胺天蓝的3.0mol/LNaCl溶液,借助微电极推进器将记录电极缓慢推进到大鼠的PF内。单位放电经微电极放大器采集、滤波(300～3000Hz)、显示于示波器,并输入计算机用Spike2生物信号采集系统处理。实验中只对信噪比>3/1和放电稳定的神经元进行记录。在进行电刺激前每一单位需记录2～3min的基础放电。1.2.2刺激部位标记在每一次电生理学记录完毕后,经微电极电泳滂胺天蓝(-20μA,15min)标记记录部位,刺激部位采用直流电损毁法标记。大鼠用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液经颈动脉灌流固定后,立刻断头取脑,放入相同固定液4h,再将脑组织移入30%的蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)至沉底后行冠状冰冻切片,片厚30μm。焦油紫染色。光镜下观察,仅取记录和刺激部位均正确的资料进行统计学分析。1.3数据分析1.3.1神经元自适应识别根据神经元放电间隔直方图(interspikeintervalhistogram,ISIH)鉴别神经元的放电形式。每个神经元ISIH的生成至少包含300个动作电位,直方图采样bin宽4ms。根据ISIH将神经元放电形式分为:(1)规则放电,ISIH呈对称性分布;(2)不规则放电,ISIH呈随机分布;(3)爆发式放电,ISIH呈明显的逐渐衰减的正偏态分布。1.3.2型1120%根据下面公式判定神经元对电刺激的反应:R=(刺激后放电频率/刺激前放电频率-1)×100%R≥20%为兴奋型反应,R≤-20%为抑制型反应,介于两者之间的为无反应。结果以平均值±标准误(x¯±sx¯)(x¯±sx¯)表示,显著性检验用t检验,P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有极显著性差异。2结果2.1放电频率的确定共记录了53个正常大鼠PF神经元的自发放电,其自发放电频率较低,放电频率在0.98～26.9Hz之间,平均为(9.27±0.74)Hz。其中多数神经元呈不规则放电,部分呈爆发放电,偶见规则放电。2.2不同频率pf神经元对不同放电频率stn的影响共观察了57个正常大鼠PF神经元对高频刺激(频率130Hz,强度0.4mA,波宽0.06ms,时程5s)STN的反应。高频电刺激STN结束后使大多数PF神经元(35/57,61.4%)的放电频率增加,平均由刺激前的(7.55±0.89)Hz增加到刺激后的(13.33±1.43)Hz(P<0.001),平均增加了(5.78±0.99)Hz。另有7个神经元抑制(7/57,12.28%),15个神经元无反应(15/57,26.32%)。实验还观察了26个PF神经元对不同频率电刺激(20、50、100、130、200Hz)STN后的反应(见表2)。结果显示刺激频率低于100Hz时,多数神经元无明显反应;刺激频率为130Hz和200Hz时,大多数神经元呈兴奋反应,放电明显增多。3高频刺激stn对stn表达的影响本实验观察到以不同频率刺激STN,刺激频率低于100Hz时,多数PF神经元无明显反应;刺激频率为130Hz和200Hz时,大多数PF神经元呈兴奋反应,放电明显增多。解剖学研究显示,STN与PF之间无直接的纤维联系。STN向黑质网状部(SNr)发出兴奋性纤维投射,而后者发出抑制性GABA能纤维投射到丘脑PF。故STN对PF神经元活动的影响可能通过该间接环路而实现。Magarinos-Ascone等发现频率为5～14Hz的低频刺激STN,引起STN抑制或无反应,但随着频率的增加,呈现抑制效应的神经元数量逐渐增高,据此他们认为高频刺激STN可以抑制STN的活动,而低频刺激STN却对STN的影响甚微。因此,结合解剖学推测,低频刺激STN对其本身无明显作用,故对SNr几乎无影响,进而SNr对下一核团PF亦无明显影响;当高频刺激STN时,高频刺激直接抑制了STN,使STN-SNr兴奋性通路功能活性降低,导致SNr向PF的GABA神经递质释放减少,从而使PF神经元受到的抑制释放,最终PF神经元兴奋。PF与基底神经节中几乎所有核团之间有着广泛的纤维联系,参与基底神经节内环路的组成,对基底节环路发挥有效的调控作用。PF是基底节环路中输入核纹状体的主要传入投射之一,且该投射为兴奋性投射。故PF兴奋将引起向纹状体的兴奋性投射增多,继而增强纹状体神经递质的释放。该推测与BruetN等的研究结果一致,其实验结果证明高频刺激STN引起纹状体神经元Glu递质的增加。纹状体作为基底神经节环路中的输入核团,其兴奋将会引起直接通路的输出