国产氯沙坦钾片人体生物等效性评价

国产氯沙坦钾片人体生物等效性评价

氯沙坦是一种选择性、竞争于血管紧张素受体的抗剂，它可以阻断血管紧张素的内源性和外源性以及各种药理作用（包括血管收缩、环磷酶释放等）。它可以选择性地影响at1受体，不影响其他激素受体或血管中重要的离子通道的功能，而是抑制血管紧张素的分解酶（激酶）。它不影响血管紧张素和缓冲液的代谢过程。其口服吸收后经首过代谢后形成羧酸型活性代谢物及其他无活性代谢物,生物利用度为25%～35%,消除半衰期在1.5～2h,为一种新型抗高血压药物。已报道的分析方法有:HPLC结合紫外检测法、荧光法等,但这些方法存在一些不足,如灵敏度低,需要血浆样本量大,相对复杂的制备过程及较长的分析时间等。为此,本试验研究以原研制剂科素亚(氯沙坦钾片)为参比制剂,采用高效液相色谱串联质谱方法(HPLC-MS/MS)检测中国健康成年男性志愿者单次空腹口服试验制剂与参比制剂后血浆中氯沙坦原型及其活性代谢产物E-3174的浓度,比较二者的药动学参数,评价试验制剂与参比制剂的生物等效性。1参比制剂r试验制剂(T):氯沙坦钾片(北京双鹤现代医药技术有限责任公司,规格:每片50mg,生产批号090223,有效期为2年)。参比制剂(R):氯沙坦钾片(科素亚),规格:每片50mg,生产批号:63-090514,失效期为2011年5月13日,默沙东公司。氯沙坦钾对照品(纯度>99%,批号:100597-200501,中国药品生物制品检定所);E-3174(纯度>99.5%,北京双鹤现代医药技术有限责任公司);甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,空白人血浆(吉林大学第一医院)。2analyst1.3数据处理软件环境API4000型三重四极杆液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子化源以及Analyst1.3数据处理软件(美国AppliedBiosystem公司);Agilent1100高效液相色谱系统,包括二元输液泵,自动进样器,切换阀(美国Agilent公司)。3受试者试验前后一般资料本试验筛选并完成20例中国健康成年男性受试者,年龄为28～36(32.23±2.27)岁,身高162～177(170.95±4.69)cm,体重61.5～80(67.18±6.64)kg,进行体格检查,体重指数在19～24,无心、脑、肝、肾、消化、内分泌、神经精神及过敏疾病史,无烟酒嗜好,心电图、血压、肝功能、肾功能、HBsAg、抗-HIV、抗-HCV及血常规、尿常规检查均正常,依从性好。试验前2周未服用任何药物,试验期间禁服其他药物及烟、酒、茶等,受试者试验前对试验目的与要求充分了解,试验前充分了解试验内容与可能出现的不良反应后,自愿签署知情同意书。试验经北京大学人民医院医学伦理委员会批准后进行。4给药及随访按两周期交叉自身对照实验设计,20名健康成年男性受试者交叉分组,分2次给药,每次口服氯沙坦钾片50mg,2次给药间隔清洗期为1周。受试者于给药前1日、给药后1日接受体格检查、心电图检查和实验室检查以评估用药安全性,给药后1日检查异常者于给药后7日复查。试验中在给药第1日于给药前0h及给药后0.25,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10,12,24,36h于上臂肘静脉各取血一次,每次4mL,肝素抗凝。采集的全血立即置含肝素的抗凝试管中,3000r·min-1离心10min后分离血浆,血浆于-40℃保存待测。5分析条件5.1%甲醛-3-腈3.ZorbaxSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm),美国Agilent公司;流动相:乙腈-0.1%甲酸(60∶40,v/v);流速:1.0mL·min-1(分流体积比1∶1);柱温:40℃;进样量:20μL。5.2解簇电压dp离子喷雾离子化源;正离子方式检测;离子喷射电压:5000V;温度:450℃;源内气体1(GS1,N2)压力:413.7kPa;气体2(GS2,N2)压力:413.7kPa;气帘气体(N2)压力:103.43kPa;扫描方式为多重反应监测(MRM);氯沙坦钾、E-3174和替米沙坦的解簇电压(DP)分别为:54、78和96V;碰撞能量(CE)分别为:30、27和60eV;用于定量分析的离子反应分别为m/z423.2→m/z207.1(氯沙坦)、m/z437.3→m/z207.3(E-3174)和m/z515.2→m/z276.1(替米沙坦)。6lc-ms/ms分析取血浆样品50μL,依次加入内标溶液替米沙坦50μL,乙腈350μL,涡流混合1min,离心10min(15000r·min-1),取上层有机相于试管中,取20μL进行LC-MS/MS分析。7法律研究与评价7.1空白血浆样品的制备分别取6名受试者的空白血浆50μL及一定浓度的氯沙坦和E-3174标准溶液以及内标替米沙坦溶液加入空白血浆中,进样20μL;取受试者给药后收集的血浆样品,依同法操作;考察氯沙坦、E-3174和内标替米沙坦的专属性及特异性。7.2hplc-ms/ms分析取空白血浆50μL,加入标准系列溶液50μL;其中氯沙坦和E-3174配制成相当于血浆浓度为1、3、10、30、100、300、1000ng·mL-1和3、9、30、90、300、900、3000ng·mL-1的血浆样品。按“6”项下操作,取20μL进行HPLC-MS/MS分析,记录色谱图;以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程,即为标准曲线。7.3质量控制因子按“7.2”项下操作,分别制备氯沙坦和E-3174低、中、高3个质量浓度(3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的质量控制(QC)样品,每浓度6样本,连续测定3d。根据当日的工作曲线,计算QC样品的测得浓度,根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度。7.4质量控制qc分别取空白血浆50μL,按“7.2”项下操作,制备低、中、高3个质量浓度(氯沙坦和E-3174浓度分别为3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的质量控制(QC)样品,每浓度4样本。同时另取空白血浆50μL,按“7.2”项下操作,向获得的上层有机相中加入混合标准溶液50μL和内标溶液50μL,配制成相应浓度,涡流混合,取20μL进行HPLC-MS/MS分析,获得相应峰面积,以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。7.5样品质量控制分别取空白血浆50μL,按“7.2”项下操作,制备低、中、高3个质量浓度(氯沙坦和E-3174浓度分别为3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的质量控制(QC)样品,每浓度4样本。同时另取水50μL,按“7.2”项下操作,制备低、中、高3个质量浓度(氯沙坦和E-3174浓度分别为3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的质量控制(QC)样品,每浓度4样本。按“7.2”项下操作,进样分析,获得相应峰面积。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应。结果显示,血浆对氯沙坦和E-3174无明显的基质抑制作用,不影响测定。8数据处理与统计分析ρmax、tmax、AUC0-t、t1/2等主要药动学参数由DAS2.1.1统计软件计算处理,以双单侧t检验进行生物等效性判定。9结果9.1固相色谱法确定样品的专属性分别取6名受试者的空白血浆50μL,按“7.2”项下操作,进样20μL,得色谱图1-A;将一定浓度的氯沙坦标准溶液和内标替米沙坦溶液加入空白血浆中,依同法操作,得色谱图1-B;取受试者给药后收集的血浆样品,依同法操作,得色谱图1-C;同法操作考察E-3174和内标替米沙坦的专属性,得图2。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰氯沙坦、E-3174、替米沙坦的测定。9.2检测线性范围和最低检测限氯沙坦典型标准曲线方程y=0.0169x+0.000127,相关系数r为0.9971,检测线性范围为1～1000ng·mL-1,最低检测限为1ng·mL-1;E-3174典型标准曲线方程y=0.000409x-0.000165,相关系数r为0.9974,检测线性范围为3～3000ng·mL-1,最低检测限为3ng·mL-1。9.3密度结果结果测定血浆样品中氯沙坦和E-3174精密度结果见表1。结果表明,日内、日间变异均小于15%,满足生物等效性研究关于生物样本分析检测方法学的技术要求。9.4市售产品出的中小型或小程序出现的以投资项目为2.2.4%,2.4%;氯沙坦低、中、高3个浓度回收率分别为(104.9±12.1)%、(104.1±9.8)%、(106.3±2.4)%;E-3174低、中、高3个质量浓度回收率分别为:(100.2±11.1)%、(102.9±10.7)%、(97.7±8.9)%。9.5检测中心出,0.3.3.3.3.3.3.38.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8%氯沙坦低、中、高3个浓度的基质效应分别为(108.0±11.9)%、(98.6±9.3)%、(98.3±8.8)%;E-3174低、中、高3个浓度基质效应分别为(103.4±11.5)%、(100.6±13.0)%、(94.1±11.3)%。9.62氯沙坦浓度的测定20名健康受试者按随机分组、自身前后对照设计,分别口服氯沙坦钾片试验制剂和参比制剂50mg后,采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定血浆中氯沙坦浓度。20名健康受试者服药后血浆中相应的氯沙坦原型及代谢产物E-3174的平均血药浓度(ρ)-时间(t)曲线见图3。9.7e-1334的表观浓度及药代动力学利用DAS2.1.1软件对20名健康受试者给予试验制剂和参比制剂后血浆中相应的氯沙坦原型及代谢产物E-3174的血药浓度数据进行分析,主要药动学参数如下:试验制剂和参比制剂中相应的原型药物的血药峰浓度ρmax分别为(207.50±68.14)、(187.23±89.92)μg·L-1;达峰时间tmax分别为(1.69±1.70)、(1.53±0.76)h;浓度-时间曲线下面积(AUC0-12h)分别为(457.79±126.46)、(442.08±137.48)μg·h·L-1;末端消除半衰期(t1/2)分别为(2.09±0.59)、(2.01±0.33)h;表观分布容积(V/F)分别为(346.23±137.63)、(342.11±92.52)L;血浆药物清除率(CL/F)分别为(115.19±35.06)、(118.84±31.89)L·h-1。代谢产物E-3174的血药峰浓度ρmax分别为(642.05±280.08)、(659.91±295.72)μg·L-1;达峰时间tmax分别为(4.10±1.86)、(4.23±1.69)h;浓度-时间曲线下面积(AUC0-36h)分别为(4702.39±1803.18)、(4703.28±1959.33)μg·h·L-1;末端消除半衰期(t1/2)分别为(4.82±0.84)、(5.13±1.94)h;表观分布容积(V/F)分别为(96.72±72.66)、(126.41±182.24)L;血浆药物清除率(CL/F)分别为(15.71±18.98)、(14.65±12.47)L·h-1。9.8氯沙坦钾片的生物利用度将氯沙坦钾片试验制剂与参比制剂的主要药动学参数AUC0-t(经对数转换)、ρmax(经对数转换)、tmax实测值采用孙瑞元教授编写的DAS统计软件进行方差分析,结果见表2～4。研究表明,口服氯沙坦钾片个体间差异较大。双向单侧t检验表明,氯沙坦AUC0-12h的[1-2α]置信区间为99.8%～121.9%,在80%～125%之间,试验制剂对参比制剂的相对生物利用度为110.3%。氯沙坦ρmax的[1-2α]置信区间为101.0%～127.0%,在70%～143%之间。结果表明,氯沙坦钾片试验制剂与参比制剂中氯沙坦的AUC0-t、ρmax、tmax均符合SFDA对生物等效性要求,故判定氯沙坦钾片试验制剂和参比制剂生物等效。