liddle综合征患者的临床特征及基因诊断

liddle综合征患者的临床特征及基因诊断

liddle综合征的发病机制李家综合征是一种常见的高血压病，具有先发高血压、低钾、低肾素和低醇血症。它对酶诱导剂（enac）钠通道（na）的抑制非常敏感，但对环磷酰胺吡啶没有敏感。近年来，由于活佛和分子遗传的发展，对lidle综合征的发病机制进行了深入研究。该综合征的遗传基础为编码ENaC的基因的β或γ亚单位发生突变引起上皮钠通道过度激活导致肾脏远曲小管对钠水重吸收增强所致。由于临床医生对继发性高血压诊治重视不够,使得Liddle综合征一直被视为一种罕见病,患者长时间被误诊,造成血压控制困难,大量应用降压药物导致药物副作用增加,早年发生心肾功能不全等靶器官损害,脑卒中甚至猝死。Liddle综合征分子遗传机制的研究使基因诊断成为快速准确诊断的有效方法,本文对两例临床疑似Liddle综合征的患者进行外周血SCNN1B和SCNN1G基因检测,明确诊断、指导治疗,打破基础医学与临床医学之间的屏障,把基础研究获得的知识成果转化为临床应用。1对象和方法1.1研究对象和方法1.1.1中心住院的临床特征2例于2010年6月至2010年10月在阜外心血管病医院高血压诊治中心住院的临床初诊Liddle综合征先证者和此两个家系的38位家系成员,先证者临床特征为发病年龄小,高血压家族史,口服多种降压药血压难以控制,低血钾,低肾素,低醛固酮,肾上腺CT检查未发现明显异常等。1.1.2首先，采集和处理样本并进行评估1.2链反应试验1.2.1外周血DNA的提取(盐析法);1.2.2采用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增目的片段;1.2.3基因测序:将相应外显子的扩增产物送至北京华大基因科技公司测序,以PCR正向引物为测序引物进行测序;2结果2.1.家庭与繁殖2.2家庭与系统22.3治疗配合性血钾两个家系中共8例Liddle综合征患者明确诊断,给予适当限钠及口服阿米洛利5mgqd,监测血压和血钾水平,疗效显著,1个月后8位患者血钾及血压水平见表1。3py基序基因突变本研究对2例青年难治性高血压患者进行了临床生化和ENaCβ亚单位和γ亚单位的基因突变检测,在编码ENaCβ亚单位的SCNNB1基因的13号外显子发现了两个错义突变(P614L和P616S),其中P614L为世界首次报道的新突变,明确了Liddle综合征的诊断,两例患者均有早发高血压家族史,收集两个家系的成员,6例家系成员(不包括先证者)被确诊为该综合征,确诊患者均接受限盐和口服阿米洛利治疗,疗效显著。Liddle综合征的临床特征最初由GrantLiddle等人在1963年详细描述,其分子基础是ENaC基因(SCNN1B和SC-NN1G)功能获得性突变,最常见的突变是β或γ亚单位C羧基末端和富含脯氨酸的高度保守序列PY基序(P:脯氨酸、Y:酪氨酸、L:亮氨酸)断裂、错义、缺失、提前产生终止密码或移码突变所致。本研究的两个Liddle综合征家系的错义基因突变均位于ENaCβ亚单位的PY基序。Liddle综合征关键性的病理生理改变是远端肾小管的ENaC对钠的重吸收增加,细胞外液容量扩张。PY基序基因突变导致Nedd4-2的WW结构域不能与ENaCβ,γ亚单位的PY基序结合,使大量活性ENaC内吞和降解不能发生,导致ENaC在远端肾小管密度增加,且持续性活化,钠重吸收增加,血压升高,醛固酮和肾素分泌受抑,钾重吸收减少,出现Liddle综合征的一系列临床症状。有关ENaC通道功能的定量研究显示,导致Liddle综合征的基因突变从增加ENaC通道的表达数量及该通道开放的几率两方面影响ENaC功能,研究者将携带引起Liddle综合征的PY基序的缺失或错义突变的ENaC在爪蟾卵细胞上表达,发现ENaC电流较野生型ENaC电流明显增加,验证了以上突变是导致Liddle综合征的原因。另有研究证实,患者淋巴细胞膜钠通道活性较正常对照者淋巴细胞膜钠通道活性明显增加。另外,Knight等发现,基因突变不仅增加细胞膜ENaC的表达,而且可以通过增加通道开放的程度使ENaC得活性处于最高状态;在鼠肾脏的集合管细胞中,EGF通过ERK1/2信号通路抑制阿米洛利敏感的钠通道电流并且降低ENaCmRNA的表达,最近有研究显示,PY基序的基因突变可阻断表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)通过细胞外信号调节激酶(extracellularsignal–regulatedkinases,ERK)信号通路抑制ENaC的表达,使远端肾小管ENaC的数量和活性大增,集合管主细胞对钠的重吸收,导致Liddle综合征;以上研究揭示了Liddle综合征分子遗传机制为最终的基因治疗积累资料,并有助于拓宽对原发性高血压的认识,阐明发病机理,开辟防治新思路。许多临床医师常常认为Liddle综合征发病率低,且对其危害认识不足,未给予足够重视,然而,最近美国一项对149例血钾低于4.0mmol/L且患有高血压的退伍军人进行调查,结果显示Liddle综合征发病率高达6%,Liddle综合征患者具有发病年龄小,容易出现靶器官损害,故对于年龄<30岁的高血压患者,一旦有高血压家族遗传史,且具有低血浆肾素活性,低血钾等特征时,应考虑进行SCNN1B和SCNN1G基因筛查,有助于早期病因诊断,早期指导治疗,Liddle综合征患者一旦确诊,给予限盐和口服阿米洛利或氨苯喋啶可收到良好的治疗效果,从而避免恶性心血管事件的发生。在征得先证者及家系成员知情同意后,采集5%EDTA抗凝静脉血,-80℃保存,用盐析法或试剂盒抽提外周血基因组DNA,-20℃保存待用。正常对照血样采自150位健康人,均无尿检和肾功能异常,无肾病家族史。家庭成员需签署知情同意书。1.2.4通过NCBI的BLAST2sequences和UCSC的BLATsearch,将测序结果与Genebank中的基因原始序列进行比对,同时对测序所得的基因序列图谱进行分析,以确定是否存在基因突变。如果存在基因突变,首先对该突变进行单核苷酸多态性分析,以确定该突变是否为已知正常多态位点,其次查询国内外文献,以排除是否为已报道突变;最后,如果确定为新的突变,尚需对150例无血缘关系的健康人群进行该位点的基因扩增,测序,以排除所发现的突变为未知人群多态位点的可能。1.3ccc、tcc突变对通过基因诊断确诊的患者给予适当限钠及口服阿米洛利5mgqd,并对其进行随访,监测血压和血钾水平。序列分析:先证者Ⅲ’-7,和家系成员Ⅱ’-7和Ⅰ’-7的βENaC13号外显子第616号密码子均发生CCC>TCC杂合错义突变,使编码的氨基酸脯氨酸(Pro)被丝氨酸(Ser)替换,见图4,正反向测序结果相同。γENaC13号外显子的扩增片段为390bp(密码子524~631),所有家系成员均未检测到任何突变。正常对照者均未发现携带P616S突变。2.2.3外周血静脉血中血的检测该家系中共有22人,先证者的大舅于46岁时猝死,生前有高血压病史,先证者的外公75岁时死于肝癌,无高血压病史。其他人员均列入研究。所有个体均在清晨卧位空腹抽取外周静脉血,作DNA抽提及生化检测,生化检测指标包括血浆肾素活性、血浆醛固酮和血钾,其结果见表1。成员:该家系来自湖北省武汉市。先证者有明确的高血压家族史,其母亲在25岁时患有高血压,血压最高达190//110mmHg,自行口服硝苯地平缓释片30mgbid,血压控制不理想,波动在160-180/100-110mmHg之间,血钾未检测。先证者父亲身体健康,无高血压病史,故此家系为母系遗传,家系图见图3。2.2.2入院后生化指标检测结果先证者2:女,17岁,患者于半年前体检发现血压升高,于当地医院测得血钾2.3mmol/L,血压210/120mmHg,给予口服氯化钾缓释片2gTid,安博诺150mgqd,倍他乐克25mgqd,硝苯地平控释片30mgbid,口服药物后,但血压水平仍波动于180-200/100-110mmHg之间,患者为明确高血压原因来阜外心血管病医院高血压诊治中心就诊,入院后生化指标检测结果:血钠:144mmol/L(正常参考值:135-145mmol/L),血钾:2.68mmol/L(正常参考值:3.5-5.5mmol/L),氯105.3mmol/L(正常参考值:96-108mmol/L),二氧化碳:27.7mmol/L(正常参考值:21-31mmol/L),肾上腺CT结果未见明显异常。2.2.1临床数据2.2.4辅助检查结果分析:家系2中3例基因突变(SCNN1BP616S)高血压患者Ⅲ’-7,Ⅱ’-7和Ⅰ’-7均表现为高血压、低血钾、低血浆肾素活性及低醛固酮血症,因此,可明确Liddle综合征的诊断。其余家系成员无高血压、低血钾等临床症状,且上皮钠通道β和γ亚单位均未发现基因突变,可排除Liddle综合征的诊断。2.1.1临床资料先证者1:男,19岁,患者于一年前体检发现血压升高,于当地医院测得血钾2.0mmol/L,血压220/130mmHg,给予口服氯化钾缓释片2gTid,倍他乐克25mgbid,硝苯地平控释片30mgbid,马来酸依那普利20mgqd,口服药物后,血压水平仍波动于190-200/100-110mmHg之间,阜外心血管病医院行辅助检查结果:生化指标:血钠:142.7mmol/L(正常参考值:135-145mmol/L),血钾:2.31mmol/L(正常参考值:3.5-5.5mmol/L),氯101.7mmol/L(正常参考值:96-108mmol/L),二氧化碳:28.8mmol/L(正常参考值:21-31mmol/L),肾上腺CT结果未见明显异常。该家系中共有25人,先证者的父亲、三伯和五叔均死于脑卒中,除成员Ⅲ3和Ⅲ4未做检查外,其他人员均列入研究。所有个体均在清晨卧位空腹抽取外周静脉血,作DNA抽提及生化检测,生化检测指标包括血浆肾素活性、血浆醛固酮和血钾,其结果见表1。2.1.3DNA序列分析:先证者Ⅲ-7,和家系成员Ⅱ-3,Ⅲ-6,Ⅲ-8和Ⅲ-9的βENaC13号外显子第614号密码子均发生CCG>CTG杂合错义突变,使编码的氨基酸脯氨酸(Pro)被亮氨酸(Leu)替换,见图2,正反向测序结果相同。γENaC13号外显子的扩增片段为390bp(密码子524～631),所有家系成员均未检测到任何突变。正常对照者均未发现携带P614L突变。2.1.4家系1分析:家系中5例基因突变(SCN