脂多糖对巨噬细胞il-1、il-6和nf-mrna表达的影响

脂多糖对巨噬细胞il-1、il-6和nf-mrna表达的影响

随着中药及其抗炎免疫机制的研究和发展，越来越多的中药及其疗效在临床上具有保障安全、价格合理的优点，已成为抗炎药的非体抗炎药和肾上腺皮质激素抗炎药，后者也是使用最广泛的抗炎药。然而,中药抗炎作用的分子机制十分复杂,通过多途径、多环节发挥抗炎作用,许多中药的抗炎分子机理还不是很清楚。目前,中药抗炎作用的分子机制研究中,大多数都从炎症的不同途径和环节对抗炎的分子机制进行研究,其中炎性细胞因子在基因转录水平的调节是当前研究的热点。巨噬细胞是一类重要的免疫细胞和炎性细胞,能够启动体内的炎症介质产生,并调控炎症反应,释放炎性细胞因子等。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁的重要成分,是引起炎症的关键细胞毒性因子,通过LPS刺激巨噬细胞产生促炎性细胞因子以建立体外炎症模型,可以模拟体内炎症反应过程,常用于抗炎药物作用机制的研究。研究中药抗炎作用机制,首先需要建立一个稳定、标准的体外炎症模型。目前,中药抗炎机制研究的体外炎症模型主要以巨噬细胞系(Raw264.7、THP-1等)为主,通过刺激细胞产生炎症反应,但该细胞系是一种半肿瘤特性的细胞系,不能完全模拟体内巨噬细胞的生物学特性。虽然也有研究者采用原代巨噬细胞为细胞来源建立炎症模型,但模型建立的标准不统一,不同研究者选择的LPS浓度和作用时间差异很大。因此采用原代巨噬细胞为细胞来源,建立稳定、标准的炎症模型,将会更准确地反映中药抗炎的分子机制。本实验通过小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养,LPS刺激巨噬细胞来模拟体内炎症反应,采用荧光定量PCR法检测LPS作用后细胞内炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA的表达变化,以期建立较合理的、标准的体外培养的小鼠巨噬细胞炎症模型。1材料和方法1.1试剂和引物SPF级昆明小鼠10只,雌雄不限,6~8周,中山大学实验动物中心提供,生产许可证号SCXK(粤)2011-0029;LPS(fromEcoli055:B5)购自Sigma公司;RPMI-1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品;Trizol、反转录试剂盒、SYBRue3ebue4d2PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)kit、引物购自大连Takara公司;FITC-CD14单抗、BDFACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。1.2细胞培养及转染脱颈处死小鼠,75%(φ)酒精浸泡5min后置于解剖台上,无菌条件下打开腹膜,腹腔注射不含血清的RPMI-1640培养液5mL。轻柔小鼠腹部3min,静置5min,用注射器抽取腹腔液约4mL,放入置于冰盒上的离心管中,重复操作2次。用TrisNH4Cl溶液溶解腹腔液中的红细胞,2000r/min,离心5min,洗涤细胞后显微镜下计数。加入含10%(φ)胎牛血清的RPMI-1640培养基,重悬细胞,调整细胞浓度,分别以不同的密度(1×105/mL、5×105/mL、1×106/mL、5×106/mL、1×107/mL)接种于50mL培养瓶中,于37℃、饱和湿度、5%(φ)CO2的条件下培养,培养6h后换液,以去掉未贴壁细胞。每2~3天换液1次。1.3大鼠腹腔疾病的形态观察细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况。1.4cd14表达水平检测用0.25%胰酶将培养3d的细胞消化下来,调整细胞密度为1×106/mL,1000r/min,离心5min弃上清,100μLPBS重悬细胞,然后加入PBS稀释的50μLCD14单抗标记细胞,避光作用30min,1000r/min,离心5min,弃上清液后PBS洗2遍,0.5mL1%BSA的PBS液终止反应,流式细胞仪上检测细胞表面CD14表达水平。1.5实时荧光定量pcr检测mrna小鼠腹腔巨噬细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板培养过夜,次日分别加入终质量浓度为0、0.1、1、10μg/mL的LPS,于24h收集细胞。同时,以1×106个/mL的密度接种于培养皿过夜培养,次日分别加入终质量浓度为1μg/mL的LPS,于0、4、8、16、24、48h收集细胞。总RNA抽提按Trizol试剂说明书进行,用紫外分光光度计测定RNA浓度。取1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。引物序列见表1。实时荧光定量PCR总反应体系为20μL,即RealMasterMix(SYBRgreen)10μL,cDNA1μL,正、反向引物各0.5μL,无菌水8μL,总体积为20μL。扩增条件:95℃2min;95℃15s、60℃30s、68℃30s,共40个循环。IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA的相对表达水平用2-△△Ct计算。GAPDHmRNA作为内参照。1.6比较方法独立样本t检验,t采用SPSS软件,所有数据以ue0af±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(one-wayANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1细胞培养和密度显微镜下观察细胞的生长情况,结果显示:细胞以1×106/mL~5×106/mL密度接种时,细胞生长最好,6h内开始贴壁;培养24h后细胞体积逐渐增大,有椭圆形、长梭形和不规则的形态;培养48h后,细胞周边或两极伸展伪足;培养5d左右,细胞生长依然良好,见图1。密度过低(低于1×105/mL)贴壁细胞少,细胞生长不良,见图2;过高(高于1×107/mL)细胞重叠生长,细胞伪足很少。2.2流式细胞培养通过流式细胞仪测得CD14表面抗体的表达量为84.55%,结果表明所分离的细胞中84.55%细胞为单核巨噬细胞。见图3。2.3种细胞因子中il-1和tnf-表达情况的变化不同质量浓度的LPS作用小鼠腹腔巨噬细胞24h对IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达均有不同程度的显著上调,在这3种细胞因子中IL-1β和TNF-α较IL-6表达水平更显著。而且在一定浓度范围内(0.1~1μg/mL),随LPS浓度增加上调作用增强(图4)。当LPS浓度为10μg/mL时,LPS的刺激效应逐渐降低,但仍高于对照组。2.4lps对tnf-mrna表达的影响1μg/mLLPS作用小鼠腹腔巨噬细胞4、12、24、48h对IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达均有不同程度的上调,而且在一定作用时间内(4~24h),随LPS作用时间延长,上调作用增强(图5)。LPS刺激4h时,各细胞因子的表达量开始显著上调,24h达到顶峰;48h时,3种细胞因子的表达量显著下调,但仍高于对照组。3细胞密度对细胞功能的影响巨噬细胞广泛分布于体内,是一类重要的免疫细胞和炎性细胞,在炎症反应中起着重要的作用。同时巨噬细胞多游离存在于腹水中,易于获得,因此许多实验室在进行中药抗炎机制研究时,往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。要建立稳定、标准的体外炎症模型,首先要获得高纯度的原代培养巨噬细胞。目前国内外报道了多种方法分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,较多采用预先注入巨噬细胞刺激剂,以诱导大量的巨噬细胞进入腹腔,通过灌洗腹腔获得大量细胞。有文献报道预先注入巨噬细胞刺激剂对巨噬细胞功能有一定的影响,获得的巨噬细胞已不再具有原体内巨噬细胞的基础功能。本实验免去了注射巨噬细胞刺激剂,通过增加易得而又便宜的小鼠数量就可解决巨噬细胞数量少的问题,避免了注入的大分子抗原物质对巨噬细胞功能的影响。体外培养细胞与体内细胞有很大的区别,体外培养细胞需要适当密度以适应外界培养环境。本实验通过显微镜观察发现,当细胞密度在1×106/mL~5×106/mL时,细胞生长良好、长出树突状的突起,从而具备巨噬细胞的形态特点。小鼠腹腔巨噬细胞获得后,要通过形态学检查,生物学功能检查和免疫学标志检查等鉴定,不同文献鉴定时选择的标准也不一样。目前鉴定巨噬细胞纯度的方法主要是通过免疫学标志检查巨噬细胞特异性表面标记,如CD14、CD11b等。本研究采用流式细胞术检测细胞表面CD14的表达水平,结果显示CD14细胞阳性率为84.55%,与文献报道的小鼠腹腔巨噬细胞的纯度相当(分别为99.2%和79.6%)。炎症反应是多细胞因子通过调节促炎和抗炎系统之间的平衡而参与炎症发生、发展的过程。目前,细胞的体外炎症模型制作常以促炎因子为手段,如LPS、TNF-α和IL-1β等,但最主要的、作用最强的、实验研究使用最多的是LPS。LPS是革兰阴性菌细胞壁的重要成分,能激活炎症细胞引起炎症反应,在炎症反应过程中,LPS通过其受体TLR4激活巨噬细胞,从而导致促炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的产生,细胞因子的分泌可诱导炎性细胞的进一步激活,从而导致过度或失控的炎症反应,最终引起宿主组织器官的炎性病理损伤。因此,在炎症反应中选取IL-1β、IL-6和TNF-α这3个经典的急性炎症早期细胞因子作为衡量模型成功与否的标准。本实验以LPS作为促炎介质,成功制作了小鼠腹腔巨噬细胞的体外炎症模型,表现为脂多糖在0.1~1μg/mL范围内4、12、2