DB21-T 3458-2021 利用KASP 标记鉴定蔬菜杂交种纯度技术规程

65.020.20CCS

B

04

DB21 DB21/T

3458—2021利用

标记鉴定蔬菜杂交种纯度技术规程Technical

for

of

the

purity

of

vegetable

hybrids

by

marker 辽宁省市场监督管理局 发

布 本文件按照GB/T

1.1—《标准化工作导则 第1定起草。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本文件起草单位：沈阳农业大学。本文件起草人：王玉刚、黄胜楠、冀瑞琴、刘志勇、李承彧、章云、任杰、孙云霞、张迎欢、屈高扬、王汝梅、冯辉。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街

2号），联系电话120024-88487135。DB21/T

3458-2021利用

1 本文件规定了利用

KASP

标记鉴定蔬菜杂交种纯度技术的引物设计、

提取和

PCR

本文件适用于已完成全基因组测序的蔬菜作物杂交种纯度快速鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

3543（所有部分）

农作物种子检验规程NY/T

2471

番茄品种鉴定技术规程

NY/T

西瓜品种鉴定技术规程

分子标记法NY/T

结球甘蓝品种鉴定技术规程

分子标记法NY/T

黄瓜品种鉴定技术规程

分子标记法NY/T

辣椒品种鉴定技术规程

分子标记法NY/T

大白菜品种鉴定技术规程

3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1全基因组重测序

Whole-genome

Resequencing指对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异SNP）、插入缺失位点（InDelSV，

Variation，CopyNumber

Variation)。3.2KASP

技术

The

Allele

Specific

PCR指可在广泛的基因组

DNA

样品中，对

SNPs（

Nucleotide Polymorphisms）和特定位点上

InDels（Insertion/Deletion）进行精准双等位基因判断的一种标记鉴定方法。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene

Diamine

Acid）Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris

）DB21/T

3458-2021KASP：竞争性等位基因特异性

（Kompetitive

Allele

Specific

PCR）PCR：聚合酶链式反应（

Chain

Reaction）5 引物设计5.1 双亲

SNP、InDel

位点筛选分别提取双亲的

DNA

和

InDel

按照

NY/T

2471～2476

给出的方法，借鉴番茄、西瓜、结球甘蓝、黄瓜、辣椒、大白菜等蔬菜作物核心

和

InDel

引物设计原则，筛选

KASP

位点。5.2

KASP

引物设

8BA1根据双亲重测序筛选的

和

InDel

位置信息，设计特异正向引物两条，通用反向引物一条。先将

或

InDel

所在位点前后各

序列，从参考基因组或测序结果中提取出来，后进入SNP

引物设计网站

/，点击“SNP

primer”，将该序列放入对话框，点“开始设计引物”，即可得到想要的引物序列。5.3 双亲引物多态性筛选设计的

KASP

DNA

为模板进行

PCR

KASP标记，每条染色体上筛选至少

2～3

对双亲间存在多态性的引物。6 仪器设备及试剂6.1 仪器设备冷冻干燥机，研磨仪，

仪，万分之一天平；微量加样器，Kube

热封仪，台式离心机，实时荧光定量

6.2 试剂Tris-HCl（1M），氯化钠，EDTA，异丙醇，无水乙醇，Assay

Mix，Master

6.3 溶液配制见附录

A。7

KASP

方法步骤7.1

按照

GB/T3543

100

菜作物种子，直播或穴盘育苗，待子叶或真叶长至直径大小约

1cm

96

孔深孔板取样。7.2

将深孔板放入冷冻干燥机

24h

2

粒钢珠或

4

粒玻璃珠，利用研磨仪研磨

2min

buffer

20min

3700r/min

20min，弃上清，加入

75%

0μL，利用离心机

3700r/min

10min，弃上清，晾干后加入重蒸水200μL。7.3

PCR

反应在

3μL。先利用微量加样器分别将

1.5μL

的待测

TemperatureTimeCycles959009461-55-0.6/cycle2060109455206026TemperatureTimeCycles94572060DB21/T

3458-2021

Mix

1.5μL

和引物的混液（36:1）加入至

384

孔反应板中，

分装完毕立即将微孔板放在

Kube热封仪上封膜；运行

PCR

程序（见表

1表

1

KASP

反应程序Table

1

Table

1

KASP

procedure扩增结束后，利用实时荧光定量

仪检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则进行加循环程序（见表

2）。每

3

个循环查看分型情况，直至分型完全。表

2

KASP

加循环反应程序Table

2

Table

2

KASP

reaction

procedure利用双亲间筛选出的具有多态性的

KASP

引物，一般选

3

对引物，扩增至少

100

粒以上样品的DNA

DNA

特征特异带型的种子数占检测样品种子数的百分率来表示纯度，计算公式如下：P%=n/N×100%.................................. (1)式中：P——纯度；n——具有本品种特征特异带型的种子数；N——检测样品种子数。DB21/T

3458-2021附

录

A（规范性）溶液配制方法A.1

buffer重蒸水

700ml，Tris-HCl

200ml，氯化钠原液（5M）50ml，EDTA

原液（0.5M）50ml，灭菌后使用。A.2

引物稀释首先将两对特异正向引物和通用反向引物分别按照引物合成单的说明配置成

100μmol/L

10μL

稀释成

10μmol/L

12: