四川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

.⑨SDSLoadingBuffer；仪器电泳仪、染液缸实验方法E.coliBL21<DE3>感受态的制备；重组子转化BL21；原核表达1挑取上述方法得到的单菌落于2mLLB液体培养基<氨苄青霉素50μg/mL>中。同时,BL21作为对照〔不加抗生素。于37℃培养至OD600为0.5；2取20μL菌液接种2mLLB液体培养基<氨苄青霉素50μg/mL>,37℃培养OD600为0.5；3加入IPTG最终浓度梯度2mM,18℃诱导表达16h；4诱导结束后,用超声波破碎细胞；51mL菌液加入100μL的SDSLoadingBuffer,100℃煮沸5min；6取30μL上清样品点样,分析SDS胶,观察表达结果；4.按下表配方制备SDS凝胶,加样。先10mA恒流电泳至分离胶,再调为15mA恒流到电泳结束；组分12%分离胶<mL>3.9%浓缩胶<mL>丙烯酰胺贮液4×Tris·Cl/SDS,pH8.84×Tris·Cl/SDS,pH6.8ddH2O10%过硫酸铵TEMED6.003.75--5.250.050.010.65--1.253.050.0250.0055.考马斯亮蓝染色将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2h；倾去固定液,以考马斯亮蓝染色液染色4h；倾去染色液,加入脱色液,缓慢摇动脱色。中间换脱色液,脱色到获得蓝色条带及干净的背景为宜。实验结果1.重组子转化的E.coliBL21<DE3>筛选鉴定通过两轮氨苄青霉素〔50μg/mL筛选成功转化重组质粒的受体菌BL21后,37℃培养至OD600为0.5,此时培养皿中呈大量灰白色带菌丝菌落,此处未用图片记录；随后重新转化摇菌,培养皿出现正常BL21菌落。2.诱导表达产物电泳检测如图1.其中编号1为Marker,2b为本实验小组电泳条带,红色方框圈出部分为γ-GCS蛋白,可见十分明亮的单一条带,但边缘处稍显弥散不够整齐。另亮条带下方仍有少许颜色较浅的杂质带,拖尾现象明显。图1.γ-GCS产物电泳图。1为Marker,2b为本小组电泳带,红色方框圈出γ-GCS产物条带,含量较高。另外,针对图1.对照组方面的缺陷,本实验还增加了如图2.改进。其中,红色方框圈出部分为IPTG诱导γ-gcs表达产物的电泳条带,9泳道加入了有IPTG诱导的pET32质粒,用以确定空质粒不表达γ-GCS,且条带较深处位于下方,说明多含小分子蛋白。8、9泳道均以单一变量原则设置为空白对照,若缺少IPTG的强诱导作用,目标蛋白γ-GCS的产量也会大大减少。123456789图2：1、2、3、4、5、6、7道：IPTG诱导的γ-GCS表达,已由红色方框圈出；8道：未加入IPTG诱导的γ-GCS表达；9道：pET32质粒加入IPTG诱导表达。分析与讨论1.重组子转化的筛选结果因第一次涂布后出现大量灰白色带菌丝菌落,而一般E.Coli菌落应呈圆形、边缘整齐且表面光滑的半透明小凸起,由此推测可能是培养基被霉菌污染所致,需重新进行涂布培养,PH达7.4最佳。2.γ-GCS电泳检测结果如图1.最明亮的条带应该是IPTG诱导目的基因所表达的产物γ-GCS,由于进行阳性重组质粒筛选后BL21携带大量目的基因γ-gcs,在IPTG诱导的情况下lac强启动子因阻遏蛋白失活而启动转录,位于其下游的γ-gcs得以表达,从图1.2b可知该实验较为成功。另外,杂质蛋白的出现经分析可能与BL21表达源性蛋白有关,也可能是LB培养基里的蛋白质有少许混入样品所致,但由于目的基因表达量较高,杂质对其影响不大。若需要更充分证明产物γ-GCS,可在pET-32aXhoI酶切位点后加入6个His标签,进一步通过His特异性抗体做Western杂交验证产物的表达,此方法对目的基因表达量很少时较适用。总结整个实验到此基本完结,从提取RNA、进行反转录得cDNA并验证、又由cDNA扩增出γ-gcs、连接质粒pET-32a后转入BL21诱导其表达,到最终得产物γ-GCS,共分五个实验,将真核生物基因克隆及表达产物的全过程分步介绍,且使我们对之有了具体理解和体会。但最后因失误忘记录蛋白质Marker、γ-GCS的分子量大