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大豆Gm2-MMP启动子分离及Gm2-MMP互作蛋白筛选大豆[Glycinemax(L.)Merr.]是世界上重要的粮食作物,是植物蛋白的主要来源。南方春大豆区是我国大豆的主产区之一,该地区大豆在种子生理成熟期(R6期-R7期)常会遭遇高温高湿的天气,种子极易发生田间劣变,导致种子活力下降。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)属于金属内肽酶中的MA簇M10家族,EC3.4.24亚类,是一类锌钙依赖型的蛋白酶。广泛分布于动物、植物体内,能降解细胞外基质的所有成分。植物MMPs可能参与发育调控、免疫应答及非生物逆境胁迫响应等多个方面。本课题组前期的差异蛋白质组学研究结果表明高温高湿胁迫后田间劣变抗性品种湘豆3号中MMPs蛋白呈上调表达。本研究在此基础上,以种子田间劣变抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号为材料开展以下研究:(1)Gm2-MMP启动子的分离,并对其顺式作用元件进行分析;(2)Gm2-MMP互作蛋白的筛选与鉴定;(3)Gm-PM31的生物信息学分析及亚细胞定位;(4)Gm-M31的组织表达特异性分析及高温高湿胁迫下Gm-PM31的表达特性分析。以期为进一步研究MMP在参与大豆生长发育和响应逆境胁迫等方面的生物学功能提供帮助。主要研究结果如下:1.在Gm2-MMP基因5’上游1596bp内分离到了该基因的启动子序列,其序列中存在热激响应(CCAATBOX1)、脱水黄化诱导(ACGTATERD1)、干旱响应(ABRELATERD1)和光调控(IBOXCORE)等顺式作用元件;通过对Gm2-MMP基因启动子5’端不同缺失片段驱动的GUS基因在烟草叶片中的瞬时表达分析发现,-359bp～-223bp对该启动子的高温高湿诱导活性是必须的。2.以Gm2-MMP蛋白为诱饵对高温高湿胁迫下抗种子田间劣变春大豆种子膜蛋白酵母双杂交文库进行筛选,初步获得39个可能与Gm2-MMP互作的蛋白,分别为:球蛋白、油体蛋白、种子成熟蛋白、白蛋白、胰蛋白酶抑制剂、蔗糖结合蛋白、水通道蛋白、富甘氦酸类蛋白、转运蛋白、MYB转录因子、60S核糖体蛋白、钙连接蛋白、脱水素蛋白、Ca2+结合EF手型蛋白以及未知功能蛋白。3.Gm-PM31生物信息学分析表明,Gm-PM31与豆科相关蛋白亲缘关系较近,且具典型的ACD-ScHsp26-like和IbpA结构域。对Gm-PM31编码的蛋白进行亚细胞定位结果表明,其定位于高尔基体。通过酵母双杂交和BiFC实验对Gm2-MMP与Gm-PM31在体内的互作进行了验证。4.qRT-PCR结果表明,Gm-PM31在宁镇1号和湘豆3号中均表现为在成熟种子中表达量最高,在成熟叶片、老叶及幼荚中有少量表达,其他组织中表达量很低甚至不表达;在大豆种子发育过程中Gm-PM31的表达量呈先上升后下降的趋势,并在开花后第45天表达量达到最大值。在种子生理成熟期进行高温高湿胁迫后,在宁镇1号种子中,与对照相比,Gm-PM31在胁

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