臭灵丹黄酮类和挥发油成分抗流感病毒及抗炎的药效研究

臭灵丹黄酮类和挥发油成分抗流感病毒及抗炎的药效研究臭灵丹是云南特色地方药和民族民间习用药,主要用于防治急性上呼吸道感染尤其是对流行性感冒疗效已得到初步证实。流感可按“温病”论治,基于中药五味配伍提出的“风淫于内,治以辛凉,佐以苦”是温病重要治法。臭灵丹性味特殊,味辛(具有特殊气味)、苦,性寒凉,单味药切合“风淫于内,治以辛凉,佐以苦”温病治法,而且是少有的兼具“辛味”的清热解毒类抗病毒中药。过往研究已证实臭灵丹含有挥发油、黄酮类等多种活性成分,这些活性成分可能与中药“药味”相关。鉴于此,可以将中药“药味-功效”理论作为线索,结合探索臭灵丹黄酮类和挥发油有效成分的抗流感药理特点,以中西医结合的思路探索臭灵丹有效成分的药理作用及其可能的机制。目的：本课题作为一项新思路探索,尝试以传统中医“药味-功效”理论及民族用药经验在单味中药抗流感研究中的指导作用。1.首先,通过现代植物化学方法,系统分离获得臭灵丹黄酮类及挥发油成分,并分析其成分,从而明确灵丹草这两类可能的不同性味物质基础。2.其次,利用抗流感、抗炎的体内外药效模型,证实臭灵丹总黄酮、挥发油这两类不同性味物质的的抗流感、抗炎药效。3.进一步从炎症因子水平、病毒介导炎症相关信号通路、细胞凋亡等不同层面阐明有效成分的的抗流感、抗炎机制。4.最终通过系统比较臭灵丹黄酮类和挥发油成分的不同药理特点,结合中医“药味—功效”理论,为这两类成分可能作为“辛”“苦”药味的代表性物质提供现代药理依据,也为阐释中药流感治疗“温病”理论提供新的科学依据。方法：一、臭灵丹黄酮类有效成分的分离鉴定和抗流感药理作用及机制研究(一)根据黄酮类化合物理化性质摸索臭灵丹总黄酮提取方法,应用反相HPLC法测定其中的洋艾素含量作为质量控制标准；运用液相色谱法从臭灵丹总黄酮中分离黄酮单体并鉴定其结构。(二)以细胞病变抑制法(CPE,CytopathicEffect)观察臭灵丹黄酮类成分对甲型流感病毒(H1N1、H3N2、09年新甲流H1N1、H9N2、H6N2和H7N3)和乙型流感(1ee)等七种流感病毒亚型的抑制作用。(三)运用实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)技术,观察臭灵丹总黄酮对流感相关的趋化因子／炎症因子mRNA表达的影响。(四)运用蛋白印迹(Westernbloting)技术,观察臭灵丹总黄酮对宿主信号通路p38/MAPK的影响。(五)运用流式细胞技术,观察臭灵丹总黄酮对流感诱发细胞凋亡的影响。二、臭灵丹挥发油的成分鉴定及抗流感、抗炎作用(一)臭灵丹挥发油的成分分析和鉴定以气相色谱-质谱检测法,分析臭灵丹挥发油的主要化学成分。(二)以细胞病变抑制法观察臭灵丹挥发油对甲型H1N1流感病毒的抑制作用；用流感小鼠模型观察臭灵丹挥发油对病毒性肺炎的体内治疗作用。(三)用耳廓肿胀实验、毛细血管通透性实验、棉球肉芽肿实验研究臭灵丹挥发油抗炎药效；用热板法、醋酸扭体法、甲醛致痛法研究臭灵丹挥发油止痛药效。成果：一、臭灵丹总黄酮的抗流感作用(一)按照本提取方法获得臭灵丹总黄酮中洋艾素含量为3.54%,实现被测成分色谱峰的基线分离,峰纯度>99%。从臭灵丹总黄酮中分离出四个黄酮单体,鉴定其结构为洋艾素、喷杜素、金腰带素和B5,6-二羟基-3,7,4’-三甲氧基黄酮(新发现化合物)。(二)臭灵丹总黄酮对多种亚型的流感病毒有体外抑制作用,在治疗模式中对甲型H1N1、H3N2、09年新甲流H1N1、FluB(lee)、H9N2、H6N2和H7N3的IC50分别为25.OOmg/mL、19.84mg/mL、45.53mg/mL、25.OOmg/mL、50.OOmg/mL、50.OOmg/mL和42.40mg/mL。(三)臭灵丹总黄酮在15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL浓度下可抑制p38/MAPK信号通路的磷酸化,呈剂量依赖性。(四)臭灵丹总黄酮能使甲型H1N1流感病毒感染细胞产生的多种炎症介质mRNA表达明显下降,并呈现一定的剂量依赖关系。臭灵丹总黄酮15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL三种浓度均可抑制甲型H1N1流感病毒感染细胞后产生的环氧化酶2(COX-2)、趋化因子CCL-5、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1α)、趋化因子CXCL9(又称MIG)、肿瘤坏死因子α(TNF-α）)、白细胞介素6(IL-6)的mRNA表达,具有统计学意义(P<0.05或0.01或0.005)。臭灵丹总黄酮30μg/mL、60μg/mL两种浓度可抑制甲型H1N1流感病毒感染细胞后产生的白细胞介素8(IL-8)mRNA表达,具有显著的统计学意义(P<0.01或0.005)；臭灵丹总黄酮低剂量组(15μg/mL)IL-8的mRNA表达有所下降,但不具统计学意义(P>0.05)。(五)臭灵丹总黄酮体外能抑制流感病毒诱导的细胞凋亡,细胞凋亡百分比：流感病毒组为10.10%,臭灵丹总黄酮30μg/mL组为8.84%,臭灵丹总黄酮60μg/mL为8.00%。二、臭灵丹挥发油的抗流感、抗炎、止痛作用(一)臭灵丹挥发油成分鉴定臭灵丹挥发油化学成分复杂(有64种),已鉴定出23种(64.041%),主要为单萜类、倍半萜类以及醇、酮、及酚类化合物,本次鉴定出的主要成分包括β-桉叶烯(9.492%)、绿花白千层醇(7.496%)、百里氢醌二甲醚(6.637%)、β-红没药烯(5.494%)、6-杜松烯(5.519%)等。(二)臭灵丹挥发油在体外对甲1型流感病毒的无抑制作用；对甲1型流感小鼠病毒感染肺炎具有抑制作用,臭灵丹挥发油治疗组小鼠肺指数较病毒组下降,低剂量组(2%,v/v)肺指数为1.74±0.08,高剂量组(4%,v/v)肺指数为1.58±0.13,与病毒组比较,有统计学差异(P<0.05),(三)臭灵丹挥发油具有一定的抗炎作用1.耳廓肿胀实验：与空白对照组比较,给予臭灵丹挥发油各组的耳肿胀度和肿胀率均有下降,其中臭灵丹高剂量组(4%,v/v)的结果具有统计学意义(P<0.01),抑制率为59.58%。2.毛细血管通透性实验：与空白对照组比较,阳性对照组、臭灵丹挥发油低剂量组(1%,v/v)、中剂量组(2%,v/v)吸光度下降,具有统计学意义(P<0.01)。3.棉球肉芽肿实验：与空白对照比较,阳性对照组、臭灵丹低(1%,v/v)、中(2%,v/v)、高剂量组(4%,v/v)肉芽肿系数下降,具有统计学意义(P<0.01或0.05)。(四)臭灵丹挥发油对醋酸和甲醛致痛有一定的止痛作用1.热板法：痛阈提高百分率与空白对照组相比,臭灵丹挥发油各剂量组在给药后60、90min后痛阈有所提高,但提高百分率无统计学差异(P>O.05)。2.醋酸扭体法：扭体次数与空白对照组相比,臭灵丹高剂量组(4%,v/v)扭体次数明显减少,有统计学差异(P<0.05),其余各组未见统计学差异(P>0.05)。3.甲醛致痛法：舔、抖左后足累计时间与空白对照组相比,阳性对照组及臭灵丹高剂量组(4%,v/v)舔、抖左后足累计时间明显减少,有统计学差异(P<0.05),其余各组未见统计学差异(P>0.05)。创新性：本课题创新性的提出基于中药“药味—功效”理论的臭灵丹多成分、多靶点抗流感作用研究的新思路：以传统中医理论“辛散”、“苦泄”以及“风淫于内,治以辛凉,佐以苦”为指引,结合现代药理研究结果,将臭灵丹挥发油作为“辛味”抗流感物质代表,以臭灵丹黄酮类物质作为“苦味”抗流感物质代表,研究臭灵丹多种抗流感活性成分及其作用机制。结论：1.从臭灵丹总黄酮中发现出一个新化合物；