分子病毒学课件

一、病毒基因組的結構與功能

緒論

二、病毒基因表達的調控原理三、病毒感染的分子機制四、病毒致癌的分子機理五、抗病毒活性物質六、病毒基因工程疫苗第一節分子病毒學的主要研究內容

一、病毒的發現時期二、病毒的化學時期1、病毒的結晶2、電子顯微鏡的應用三、病毒研究的細胞水準時期四、分子病毒學的研究時期

第一節病毒的定義第二節病毒的分類和命名一、病毒分類和命名的規則（一）一般規則（二）分類階元的命名規則（三）種的規則（四）屬的規則（五）亞科的規則（六）科的規則（七）目的規則（八）亞病毒感染因數的規則（九）書寫規則二、病毒分類原理及其依據（一）病毒分類原理（二）病毒分類的依據1、病毒粒子特性2、病毒抗原性質3、病毒生物學特性（三）病毒種的概念及其分類依據（1）基因組序列的相關性（2）天然的宿主範圍（3）細胞和組織的嗜親性（4）致病和細胞病變特點（5）傳播方式（6）生理生化性質（7）抗原特性三、病毒分類系統第三章病毒的結構極其基因組第一節病毒的結構組成一、病毒的包膜（一）病毒包膜的來源（二）病毒包膜的化學組成1、病毒包膜所含有的脂類2、病毒包膜糖蛋白（三）病毒包膜的功能1、病毒吸附2、細胞融合活性3、血溶活性4、抗原性二、病毒的衣殼（一）衣殼的組成（二）衣殼蛋白的功能1、保護病毒基因組2、決定病毒的抗原性3、吸附作用4、血凝作用三、病毒的內含物第二節病毒的形態結構類型一、螺旋對稱的病毒殼體二、二十面體對稱的病毒殼體三、複合對稱的病毒殼體第三節病毒的基因組一、病毒的核酸類型二、病毒核酸的大小及其堿基的組成三、病毒基因組的結構特徵（一）DNA病毒基因組1、雙鏈DNA病毒基因組2、單鏈DNA病毒基因組（二）RNA病毒基因組1、正鏈RNA病毒基因組2、負鏈RNA病毒基因組3、雙鏈RNA病毒基因組（三）病毒基因組結構的複雜性1、粘性末端2、末端冗餘3迴圈排列

4、回文結構5、末端反向重複序列

6、重疊基因7、分段基因組8、帽子和poly（A）結構

9、其他結構特徵

第四章病毒的吸附、侵入和脫殼第一節病毒的吸附一、病毒的吸附蛋白1、細胞受體結合區2、融合區3、跨膜區4、膜內區二、病毒的細胞受體1、細胞受體單位2、細胞受體位點三、病毒吸附蛋白與細胞受體結合的機制1、可逆性吸附2、不可逆性吸附3、影響病毒吸附的環境因素第二節病毒的侵入一、注射式侵入二、細胞內吞三、膜融合四、直接侵入第三節病毒的脫殼第五章病毒基因組的複製第一節病毒基因組複製的基本特點一、全保留複製和半保留複製二、病毒基因組的複製起始三、病毒基因組的複製方向四、連續複製與不連續複製第二節病毒基因組複製所需的複製酶一、依賴於宿主細胞的複製酶二、病毒基因組自身編碼的複製酶1、DNA病毒自身編碼的複製酶及其相關蛋白2、RNA病毒自身編碼的複製酶三、病毒蛋白與宿主蛋白構成的病毒複製酶第三節病毒基因組的複製與調控一、病毒基因組複製的主要方式1、複製叉方式2、滾環方式3、鏈置換方式二、dsDNA病毒基因組的複製1、T4噬菌體基因組DNA的複製2、腺病毒基因組DNA的複製3、痘病毒基因組DNA的複製4、乙型肝炎病毒（HBV）基因組DNA的複製5、SV40病毒基因組DNA的複製三、ssDNA病毒基因組的複製1、自主性細小病毒基因組DNA的複製2、依賴性細小病毒基因組DNA的複製四、dsRNA病毒基因組的複製五、+ssRNA病毒基因組的複製

1、脊髓灰質炎病毒基因組的複製2、+ssRNA噬菌體基因組的複製六、-ssRNA病毒基因組的複製七、病毒基因組DNA複製的調控1、174DNA複製的調控2、噬菌體DNA複製的調控3、SV40DNA複製的調控4、腺病毒DNA複製的調控

病毒基因病毒包括mRNA轉錄和蛋白質翻譯兩個不同的過程。首先以病毒基因組核酸（DNA或RNA）為膜板，在病毒或宿主特異性RNA聚合酶的作用下，依照堿基配對互補的原則，轉錄生成病毒mRNA，然後這些轉錄生成的mRNA攜帶病毒的基因資訊，進入宿主細胞的核搪體上，再經過翻譯，合成病毒蛋白外，還有病毒基因組複製、轉錄所需的酶如複製酶、轉錄酶，，以及一種或幾種調節蛋白，有包膜的病毒直至合成包膜糖蛋白。第六章病毒的基因表達

由於病毒缺少編碼核糖體的遺傳資訊，因而其蛋白質翻譯完全依賴宿主的翻譯體系，但病毒RNA通過同宿主細胞核糖體結合，可以改變宿主核糖體的合成路線，使之合成病毒蛋白而不在合成細胞蛋白。第一節病毒基因轉錄和轉錄後加工一、病毒基因轉錄的特點（一）病毒的早期轉錄和晚期轉錄

病毒基因轉錄有先後之分，即按不同時序進行轉錄的，這是病毒基因表達的重要特點之一。病毒的早期轉錄一般發生在病毒感染初期，其早期基因主要編碼合成與病毒基因組複製以及晚期基因表達相關的酶和蛋白質；而病毒的晚期轉錄則出現在病毒基因組複製之後，其晚期基因主要編碼合成病毒結構蛋白如衣殼蛋白、包膜糖蛋白等。

腺病毒基因組DNA進入宿主細胞核後，首先啟動早期轉錄，然後進行中期和晚期轉錄。在腺病毒的dsDNA中，3’-5’鏈稱為γ鏈，轉錄方向從左到右；5’-3’鏈稱為l，轉錄方向從右到左，早期轉錄除了出現在l鏈上外，也出現在γ鏈上，如早期基因區E1A、E1B和E3在γ鏈上轉錄，E2A、E2B和E4在l鏈上轉錄；晚期轉錄如L1、L2、L3、L4、L5基因區的轉錄均發生在γ鏈上。1、腺病毒的早期轉錄

E3基因區在76.6~86.2mu之間，其啟動子在76.6mu處，該區至少轉錄6種mRNAs，它們分別編碼14KD、14.7KD、11KD、10KD、16KD和19KD蛋白。雖然E3並非是病毒生長和複製所必須的，在缺少大部分或全部E3區的情況下，Ad仍能在組織培養上繁殖，但一些證據表明，E3區編碼的19KD糖蛋白能夠結合位於內質網中的MHC多肽的重鏈，並且阻止MHC進一步轉移到細胞表面，從而降低細胞毒性T淋巴細胞對Ad感染靶細胞的識別。2、腺病毒的晚期轉錄

所謂非對稱性轉錄是指病毒基因的轉錄並不固定在一條DNA鏈上，其中一些基因從一條鏈上轉錄，而另一些基因從另一條鏈上轉錄，因而使轉錄方向有左向和右向或者順時針和逆時針的區別。（二）病毒的非對稱性轉錄（三）病毒的多基因轉錄和單基因轉錄

所謂多基因轉錄是指多個基因聯合轉錄在一條鏈上，這樣的mRNA也稱為多順反子（polycistroicmRNA）；單基因轉錄是指一個基因單獨轉錄在一條mRNA鏈上，這樣的mRNA也稱為單順反子mRNA（polycistroicmRNA）。（四）病毒轉錄方式的差異

由於病毒基因組具有線狀或環狀，單鏈或雙鏈，正鏈或負鏈區分，因而mRNA的轉錄方式也各有不同。對於dsDNA病毒來說，它們能以任意一條鏈為範本轉錄出mRNA；ssDNA病毒則必需以其單鏈為範本，首先複製形成另一條鏈子代DNA鏈，再由二者結合形成dsDNA後，才能從其中任意一條鏈上轉錄合成mRNA；對於+ssRNA病毒而言，其基因組+ssRNA或者直接作為mRNA，或者先複製一條與親本+ssRNA互補的-ssRNA，再以-ssRNA為範本轉錄產生mRNA；然而-ssRNA病毒可以直接以-ssRNA為範本合成mRNA；dsRNA病毒則是以其中的負鏈RNA為範本進行全保留轉錄而合成mRNA；逆轉錄病毒比較特殊，其+ssRNA基因組在逆轉錄酶的催化下合成一條cDNA鏈，再以cDNA鏈為範本複製出另一條DNA鏈，由兩條DNA結合形成原病毒dsDNA，然後原病毒dsDNA整合到宿主細胞染色體DNA上，以整合的原病毒dsDNA作為範本轉錄合成Mrna。

二、病毒基因轉錄所需要的轉錄酶

（一）病毒利用宿主的RNA聚合酶（二）病毒粒子攜帶的轉錄酶（三）病毒在複製迴圈中自身編碼的轉錄酶（四）病毒蛋白和宿主蛋白共同構成的轉錄酶三、病毒基因的轉錄啟動子與轉錄起始

一些DNA病毒的基因轉錄除了需要RNA聚合酶和適宜的範本外，其基因組DNA上也有類似於原核生物和真核生物的轉錄啟動子和轉錄起始位點，真核DNA病毒甚至還含有增強子序列，這些特定的調控元件直接參與了病毒基因轉錄的起始和轉錄調控。真核-ssRNA病毒如副粘病毒、彈狀病毒的基因組雖然沒有轉錄啟動子，但其轉錄起始與先導序列區以及基因接頭區的特定核苷酸序列有關。（一）DNA噬菌體基因轉錄的啟動子1、-10區在距離轉錄起始位點第一個核甘酸的上游-13~-4位堿基處有一段序列叫做Pribnowbox，即-10區，典型的Pribnowbox

的保守序列為TARAAT，其中第6個堿基全是T，故稱為保守T，由於-10區富含AT序列，因而易於變性和解鏈。2、-35區-35區位於Pribnowbox左側，其共同序列為TTGACA。（二）真核DNA病毒基因轉錄的啟動子與增強子1、TATAbox真核DNA病毒與真核生物一樣，在基因轉錄起始位點的上游有一個保守的啟動子序列，它有TATAA（T）AA（T）組成，稱為~，又叫Hognessbox或Goldberg-Hognessbox，其位置不在-10區，而在-30區~-20區。TATAbox靠近轉錄起始位點，主要參與病毒mRNA轉錄起始點的選擇，與轉錄起始的精確性有關。如果TATA區出現堿基缺失或突變，都會對轉錄產生嚴重影響，如在腺病毒晚期啟動子TATA區，出現含有TATA序列的-47~-21區缺失，其晚期基因完全不能轉錄，而且即使G或A替代啟動子TATAbox中的第三個堿基T形成TAGA或TAAA，也會引起基因轉錄下降。2、CAATbox和GCbox真核DNA病毒在轉錄起始位點上游-110~-40區還有另外兩種啟動子序列，一個啟動子序列為GGC（T）CAAT（A），其中CAAT序列相當保守，故稱CAATbox；另一個啟動子序列為CCGCCC或GGCGGG，稱為GCbox。HSVtk基因在TATAbox的上游有一個CAATbox和2個GCbox，HSVa4基因沒有CAATbox，但有5個GCbox。

CAATbox和GCbox雖然不參與轉錄起始點的確定，但一些細胞轉錄因數如NF1與CAATbox結合，SP1與GCbox結合，可以促進RNA聚合酶II的轉錄，提高病毒基因轉錄的效率。3、增強子是指能使與它連鎖的上游或下游基因轉錄頻率明顯增強的DNA序列。在SV40基因組中首次發現了增強子，它位於SV40早期基因上游-250~-107bp，含有兩個正向重複序列，每個長度為72bp，其核心序列為GGTGTGGAAAG。具有如下特點：（1）轉錄增強效應明顯，增強子一般能使基因轉錄頻率增加10~200倍，有的可以增加上千倍。（2）增強效應與位置和取向無關，不論增強子是在基因的上游或下游，均表現出增強效應。（3）增強子一般為重複序列，長度在50bp以上，通過特定的轉錄基因與其結合，可增進轉錄作用。（4）增強效應有嚴格的組織和細胞特異性，但對其所作用的基因無專一性。（5）有的病毒增強子還受外部信號的調控，如小鼠乳腺瘤病毒啟動子的上游大約-100bp處，有一個增強子序列，它是固醇類激素與其受體蛋白所形成的複合物結合到該增強子序列上之後，不僅能促進下游基因的轉錄，而且還能促進上游基因的轉錄。4、帽子位點存在於啟動子的下游，它是真核DNA病毒mRNA的轉錄起始位點，病毒基因轉錄範本鏈上帽子位點的堿基一般為T，這樣mRNA摻入的第一核苷酸就是ATP。（三）病毒的轉錄起始

宿主RNA聚合酶或病毒編碼的RNA聚合酶對病毒基因啟動子的識別和特異性結合，是轉錄起始的關鍵步驟。就是T4、T7噬菌體的早期轉錄而言，細菌RNA聚合酶全酶中的亞基負責識別和尋找早期轉錄啟動子，它與RNA聚合酶全酶特異性地結合這些基因的轉錄啟動子，以及進行精確的轉錄起始有關……顯然核心酶催化的轉錄起始是隨機的。四、病毒的轉錄終止（一）轉錄終止子

目前在噬菌體DNA範本鏈上發現有轉錄終止位點，即終止子，這些終止子具有共同的結構特徵：其終止子上游存在有反向重複序列，該序列富含GC堿基對，由此段DNA轉錄產生的RNA易於形成髮夾結構，在終止點的下游有一段由48個A組成的序列，因而轉錄產物的3’端帶有寡聚U，這兩種結構特徵的存在決定了轉錄終止，當新生RNA出現髮夾結構時，會導致RNA聚合酶暫停，破壞RNA-DNA雜喝鏈的正常結構；而寡聚A的存在又能使雜合鏈中的RNA3’端產生不穩定的A：U區域；結果二者共同作用導致RNA從DNA範本鏈上解離下來。

轉錄終止子有兩種類型：一類是不依賴於蛋白輔助因數，即ρ因數的終止子；另一類是依賴於ρ因數的終止子從圖可知不依賴ρ因數的終止子在結構上除了莖的長度不同外，都有富含GC區，而且莖-環結構之後都帶有一個ploy（U）區；而依賴於ρ因數的終止子既缺少富含GC區，也無ploy（U）尾。1、不依賴ρ因數的轉錄終止

2、依賴ρ因數的轉錄終止（二）抗轉錄終止作用

五、病毒的轉錄後加工和拼接

通常噬菌體mRNA5’端缺少帽子，3’端也無poly（A）尾，其合成的mRNA大多不需要加工，一經轉錄就可以直接翻譯合成病毒蛋白，但某些DNA噬菌體的基因轉錄產生的多順反子mRNA，需要經過核酸內切酶切割成較小的片段，才能進行翻譯。真核DNA病毒轉錄的mRNA大都需要在5’端戴帽和3’端加尾，除此而外，轉錄初產物還需要先切除內含子，再進行拼接，最後才形成成熟的Mrna。（一）病毒mRNA5’端的戴帽

大多數真核病毒mRNA的5’端都有以5’-5’結合的7甲基化鳥苷酸殘基封閉的結構，稱為帽子0如果在原mRNA第一個核苷酸2’-O位上繼續產生甲基化，則形成帽子1，第二個核苷酸2’-O位上甲基化，構成帽子2。真核病毒mRNA5’帽子有以下功能（1）帽子結構作為核糖體識別mRNA的信號；（2）帽子結構增加了病毒mRNA的穩定性，使之棉遭宿主細胞核酸酶的攻擊。（3）帽子結構能被蛋白質合成的起始因數所識別，從而促進病毒蛋白的合成。（二）病毒mRNA3’端加ploy（A）尾

幾乎所有研究過的動物病毒的mRNA3’端都有ploy（A）尾，長度一般短於真核細胞mRNA3’端的ploy（A）尾。目前已經發現在ploy（A）位點上游的10~25個核苷酸處都存在有加尾識別信號序列AAUAAA，其內切酶能夠識別AAUAAA序列。病毒mRNA的ploy（A）尾主要與其在細胞質中的穩定性有關，一般而言，ploy（A）短的mRNA半衰期也短，ploy（A）長的mRNA則半衰期也長。（三）病毒mRNA前體的拼接

在病毒內含子兩端也有類似於真核生物結構基因的拼接供體和受體信號，即5’！GU……AG！3’，通過宿主細胞的拼接體系識別該信號，可以促進病毒mRNA前體的拼接。在這裏5’GU和3’端AG信號對mRNA前體的拼接是十分重要的。

一些研究還證實內含子的內部序列也可以影響mRNA前體的拼接效率Khoury曾分離得到SV40早期基因T缺失的突變株，這些缺失發生在早期基因的內含子中，雖然它們並未涉及到拼接信號，但其早期的初轉錄產物與野生型SV40相比，經過切割和拼接產生的成熟mRNA以及翻譯合成T抗原的量都大為減少，究其原因可能是由於宿主拼接酶系的作用還要求mRNA前體有特定的二級或三級空間構型的緣故，而維持這種空間構型則需要有內含子序列的存在。在真核細胞中存在多種豐富的小分子叫做核內小RNA（smallnuclearRNA，snRNA），其中參與mRNA前體拼接的主要有U1、U2、U4、U5和U6snRNA，這些snRNA經常與核內的幾種蛋白質結合形成核內小核糖核蛋白（smallnuclearribonuleoprotein，snRNA），並與mRNA前體共同組成一個拼接體（spliceosome）

從上述可以看出，病毒mRNA前體的拼接既受控於宿主細胞的拼接系統，也需要有病毒自身編碼的調節蛋白以及轉錄產生的“拼接RNA”起作用。第二節病毒蛋白的翻譯及其翻譯後加工

病毒mRNA翻譯合成蛋白質的過程是在核糖體上進行的，其核糖體完全由宿主細胞的組分構成，沒有任何病毒組分的參與，因此病毒類似於宿主細胞mRNA的翻譯過程，而病毒蛋白產物的翻譯後加工則不盡相同。一、核糖體對病毒mRNA起始密碼子的識別與翻譯起始

真核生物核糖體40S亞基上的18SrRNA3’端雖然沒有原核生物16SrRNA那樣的CUCCA序列，而且真核生物和真核病毒mRNA5’也沒有SD序列，但其mRNA5’端的帽子結構可作為核糖體40S亞基以及起始因數eIF3、eIF4B、eIF4F、eIF4A的識別和結合信號。一些研究還發現，真核病毒mRNA除了5’端帽子結構與病毒蛋白合成起始有關外，在起始密碼子子AUG附近可能亦存在與18rRNA3’末端互補的序列。大多數噬菌體和真核病毒蛋白翻譯是從mRNA上的起始密碼子AUG起始的，但副粘病毒PORFmRNA上的AUG、GUG和ACG均可作為起始密碼子，翻譯合成不同的蛋白質。

二、病毒蛋白的翻譯後加工（一）病毒蛋白前體的切割（二）病毒蛋白的化學修飾

有些病毒蛋白在宿主細胞核糖體上合成後，需要經過切割和共價修飾，即進行翻譯後加工，才能形成成熟而有功能的蛋白質，如一些病毒多蛋白前體的切割，糖基化和磷酸化修飾等其修飾作用包括磷酸化、甲基化和脂醯化等。1、病毒蛋白的磷酸化

宿主或病毒編碼的蛋白激酶能將ATP末端的磷酸基團轉移到病毒蛋白的Ser，Thr和Tyr殘基上，使之形成磷酸化蛋白，磷酸化是蛋白質翻譯後廣泛存在的一種化學修飾，是控制酶活性的重要步驟。2、病毒蛋白的糖基化

一些動物病毒的包膜蛋白在翻譯後產生糖基化，形成糖蛋白突起，它與病毒粒子的吸附和侵入有關。通常這些寡糖經過N-或O-糖基化連接於Asn、Ser和Thr殘基上，糖基化作用往往發生在內質網和高爾基體中。

干擾素第一節干擾素基因及其編碼的蛋白質一、I型干擾素基因和蛋白產物二、II型干擾素基因和蛋白產物第二節干擾素的誘導合成一、I型干擾素的合成二、II干擾素的合成第三節干擾素受體及信號傳遞途徑一、干擾素受體二、干擾素的信號傳遞途徑第四節干擾素誘導的抗病毒作用一、2-5（A）合成酶和RNaseL途徑二、dsRNA依賴性蛋白激酶途徑三、Mx蛋白的抗抗病毒機制四、其他干擾素誘導蛋白的抗病毒作用第五節病毒抗干擾素作用的對策第十一章噬菌體分子生物學第一節噬菌體的結構組成一、有尾噬菌體的結構（一）殼體組成1.頭部2.尾部

（二）有尾噬菌體的核心1.T偶數噬菌體核心2.λ噬菌體核心3.其他有尾噬菌體的核心二、球部噬菌體的結構（一）殼體結構（二）球形噬菌體的核心三、絲狀噬菌體的結構第二節噬菌體基因組的結構一、DNA噬菌體基因組（一）dsDNA噬菌體基因組1.Λ噬菌體基因組的結構

2.T4噬菌體基因組的結構（二）ssDNA噬菌體基因組1.

φX174噬菌體基因組的結構2.M13噬菌體基因組的結構二、RNA噬菌體基因組第三節噬菌體基因組的複製一、DNA噬菌體基因組的複製（一）dsDNA噬菌體基因組的複製1.λ噬菌體DNA複製2.T7噬菌體DNA複製（二）ssDNA噬菌體基因組的複製1.以親代環狀+ssDNA分子為膜板合成互補的負鏈2.子代+ssDNA的合成二、RNA噬菌體基因組的複製第四節噬菌體基因組轉錄與翻譯的調控一、噬菌體基因組轉錄的調控1.λ噬菌體的轉錄的調控2.T7噬菌體的轉錄調控3.其他噬菌體的轉錄調控二、噬菌體翻譯的調控1.反義RNA在λ噬菌體基因Q翻譯中的調控作用2.R17噬菌體RNA二級結構對翻譯的調節

第五節噬菌體溶原性感染一、噬菌體溶原化狀態的建立二、噬菌體基因組的整合三、原噬菌體的割離四、轉導1.普遍性轉導2.局限性轉導第六節基因克隆的噬菌體載體一、λ載體（一）酶切位點的去除與再建1.EcoRI位點的去除2.λ同類噬菌體的重組3.酶切位點的再建（二）遺傳標記與λ載體的重組（三）Spi重組體的篩選（四）chi位點的引入（五）表達載體的構建二、粘粒載體三、M13載體第十二章動物病毒分子生物學第一節動物dsDNA病毒一、嗜肝DNA病毒科（一）病毒粒子的結構（二）病毒基因組及其編碼蛋白（三）病毒的複製與轉錄（四）病毒粒子的組裝與釋放1.20nm空心顆粒的組裝2.Dane顆粒的組裝與釋放（五）嗜肝DNA病毒與肝細胞癌二、痘病毒科（一）病毒粒子的結構及其化學組成（二）病毒基因組極其編碼蛋白（三）病毒粒子所包含的多肽和酶（四）病毒的侵入與脫殼1.病毒的侵入2.病毒粒子的脫殼（五）病毒的基因表達1.早期轉錄2.中期轉錄3.晚期轉錄（六）病毒粒子的組裝與釋放（七）痘苗病毒作為外源基因表達的載體

第二節動物ssDNA病毒一、細小病毒基因組及其編碼產物二、細小病毒的複製與轉錄（一）自主細小病毒（二）依賴細小病毒三、AAV作為基因克隆的載體四、AAV與抑癌作用

第三節動物dsRNA病毒一、呼腸孤病毒粒子的結構二、呼腸孤病毒的基因組三、呼腸孤病毒編碼的蛋白質及其功能（一）病毒結構蛋白（二）病毒非結構蛋白四、呼腸孤病毒的複製（一）病毒的侵入（二）病毒的轉錄與複製（三）病毒粒子的組裝與釋放第四節動物-ssRNA病毒一、正粘病毒科（一）流感病毒粒子的結構（二）流感病毒的基因組及其編碼蛋白1.P基因與P蛋白2.NP基因與NP蛋白3.HA基因和HA蛋白4.NA基因與NA蛋白5.RNA7基因及其編碼產物6.RNA8基因與NS1、NS2蛋白（三）流感病毒複製與基因表達的調控1.流感病毒粒子的侵入與脫殼2.流感病毒的mRNA轉錄3.流感病毒基因組的複製4.流感病毒基因表達的調控（四）流感病毒粒子的組裝與釋放二、副粘病毒科（一）副粘病毒粒子的結構（二）副粘病毒基因組及其編碼產物1.NP蛋白2.P蛋白3.C蛋白4.V蛋白5.L蛋白6.M蛋白7.病毒包膜糖蛋白8.肺病毒的NS1和NS2蛋白（三）副粘病毒基因組的轉錄與複製三、彈狀病毒科（一）彈狀病毒粒子的結構1.病毒包膜2.核衣殼（二）彈狀病毒基因組的結構（三）彈狀病毒的轉錄與複製1.病毒吸附、侵入和脫殼2.病毒基因組轉錄3.病毒基因組複製4.病毒粒子的組裝與出芽四、布尼亞病毒科（一）布尼亞病毒粒子的結構（二）布尼亞病毒的基因組及其編碼蛋白1.SRNA節段的編碼產物2.MRNA節段的編碼產物3.LRNA節段的編碼產物（三）布尼亞病毒的轉錄與複製1.布尼亞病毒的轉錄2.布尼亞病毒的基因組複製五、沙粒病毒科（一）沙粒病毒粒子的結構（二）沙粒病毒的基因組及其編碼蛋白（三）沙粒病毒的轉錄與複製（四）沙粒病毒的DI顆粒和DIRNA第五節動物+ssRNA病毒一、小RNA病毒科（一）小RNA病毒粒子的結構（二）小RNA病毒的基因組（三）小RNA病毒的複製機制1.小RNA病毒的基本複製週期2.小RNA病毒的吸附、侵入和脫殼的機制3.多蛋白的合成與切割4.小RNA病毒基因組複製（四）小RNA病毒粒子的形態發生二、冠狀病毒科（一）冠狀病毒粒子的結構與結構蛋白圖1-1冠狀病毒粒子的結構模式圖（動物病毒學殷震）Fig.1-1.ModelofCoronavirusParticle（二）冠狀病毒基因組結構圖1-2.冠狀病毒基因組示意圖（分子病毒學徐耀先）Fig.1-2.ModelofCoronavirusGenome（三）冠狀病毒的複製機制1.冠狀病毒的感染2.冠狀病毒的轉錄與複製3.冠狀病毒mRNA的表達4.冠狀病毒結構蛋白的翻譯後加工（四）冠狀病毒粒子的出芽與翻譯三、披膜病毒科（一）披膜病毒粒子的結構（二）披膜病毒基因組的結構圖1-4.冠狀病毒的複製模式（分子病毒學徐耀先）Fig.1-4ModelofCoronavirusReplication圖1-3亞基因mRNA的轉錄模式（分子病毒學徐耀先）Fig.1-3ModelofsubgenomicmRNATranscriptionORF1SORF3sMMNORF7UTRLeadersequcencePoly(A)CUAAACEncodedfragmentt+mRNA5’—mRNA3’12S34sM5M6N7圖.1-7冠狀基因組結構及表達模式圖Fig.1-7Outlineofstructureandexpressionof（三）披膜病毒的複製與基因表達1.甲病毒的複製和基因表達2.風疹病毒的複製（四）披膜病毒的DI顆粒四、黃病毒科（一）病毒粒子的結構（二）病毒基因組的結構及其編碼蛋白（三）病毒基因組的複製第十三章腫瘤病毒分子生物學與癌基因第一節DNA腫瘤病毒一、腺病毒（一）腺病毒粒子的結構（二）腺病毒的複製迴圈（三）腺病毒引起細胞轉化的分子機制1.腺病毒轉化作用的基因片段2.腺病毒的轉化基因E1A和E1B及其編碼產物3.E1A和EIB蛋白的調節功能及其轉化活性二、多瘤病毒（一）病毒粒子的結構（二）病毒基因組（三）病毒增殖性感染1.病毒的侵入2.早期基因表達3.晚期基因表達4.病毒粒子組裝和宿主細胞裂解（四）病毒基因表達的調控1.早期基因表達調控區2.晚期基因表達調控區3.增強子4.複製原點（五）SV40與小鼠多瘤病毒的轉化作用1.病毒轉化基因的發現2.病毒轉化蛋白的致癌機理三、乳頭瘤病毒（一）HPV型別與不同類型腫瘤1.皮膚疣與皮膚癌2.生殖道疣和生殖道癌3.口腔與呼吸道腫瘤（二）乳頭瘤病毒粒子結構（三）乳頭瘤病毒基因組結構（四）乳頭瘤病毒的基因表達1.早期基因表達2.晚期基因表達（五）乳頭瘤病毒的癌基因及其轉化作用機制四、皰疹病毒（一）皰疹病毒粒子的結構（二）皰疹病毒基因組結構及其功能1.病毒基因組的異構體2.皰疹病毒的基因組3.病毒基因及其編碼產物（1）立即早期基因及其蛋白產物（2）早期基因及其蛋白產物（3）晚期基因及其編碼產物（4）病毒潛伏感染期表達的基因和蛋白產物1）EBNA基因家族2）LMP基因3）EBERs基因4.病毒基因組的調空區（三）皰疹病毒的基因表達與基因組複製1.病毒的基因表達2.病毒的基因組複製（四）皰疹病毒的細胞轉化及其致癌作用1.EBV的癌基因2.EBV癌基因的轉化作用3.ESV與腫瘤（1）EBV與鼻煙癌（2）EBV與BL（3）EBV與其他腫瘤第二節RNA腫瘤病毒——逆轉錄病毒一、RNA腫瘤病毒的分類地位（一）α逆轉錄病毒（二）β逆轉錄病毒屬（三）γ逆轉錄病毒屬（四）δ逆轉錄病毒屬（五）ε逆轉錄病毒屬二、病毒粒子的結構三、病毒的基因組A型顆粒B型顆粒C型顆粒（一）基因組編碼區1.Gag基因⒉.pol基因3.pol基因4.env基因（二）基因組的末端結構1.R序列2.U5序列3.PB位點4.先導序列5.PP序列6.U3序列四、病毒的結構蛋白1.包膜蛋白2.核心蛋白3.酶五、病毒的基因組複製與基因表達（一）基因組RNA的逆轉錄和原病毒DNA合成（二）原病毒DNA的整合（三）病毒基因的表達1.病毒基因的轉錄2.轉錄後加工3.病毒mRNA的翻譯六、逆轉錄病毒的致癌作用與癌基因（一）病毒癌基因及其致癌機制1.Src與abl癌基因2.Sis癌基因3.erbB和fims癌基因4.Ras癌基因家族5.Myc癌基因及其核癌基因6.Mos與raf癌基因（二）原病毒DNA插入和整合對細胞癌基因的順式啟動（三）HTLV-1調節蛋白P40tax的反式啟動作用第三節人類免疫缺陷病毒的分子生物學一、HIV基因組結構的複製性（一）結構基因1.Gag基因2.pol基因3.env基因（二）附加基因與調節基因1.Vif基因2.vpr基因3.tat基因4.rev基因5.Nef基因6.vpu基因7.vpx基因二、HIV基因表達的調控（一）LTR中的轉錄啟動子（二）增強子（三）Tat和Rev蛋白及其效應元件對HIV基因表達的影響三、HIV感染的分子基礎（一）CD4與HIV的嗜親性（二）gp120與CD4分子在HIV吸附過程中的相互作用（三）gp120的V3環對HIV感染的影響四、HIV潛伏感染與啟動五、AIDS的發生機理（一）細胞素與AIDS（二）T4細胞耗竭（三）自身免疫與B細胞啟動六、抗HIV治療及其疫苗的展望（一）阻斷病毒吸附和建立感染（二）病毒逆轉錄和蛋白酶活性的抑制（三）HIV疫苗的研製第十四章亞病毒分子生物學第一節類病毒1.馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科2.鱷梨白斑類病毒科一、類病毒的分子結構（一）T結構區（二）P結構區（三）C結構區（四）結構區二、類病毒的結構轉換三、類病毒的複製和剪接第二節衛星RNA和衛星病毒一、衛星RNA和衛星病毒的分類1.A型衛星2.B型衛星3.C型衛星4.D型衛星二、衛星RNA和擬病毒三、衛星病毒第三節朊病毒一、朊病毒病二、朊病毒蛋白及其結構型轉變三、PrP基因與朊病毒蛋白的合成四、朊病毒的複製第四節丁型肝炎病毒一、HDV病毒粒子的結構二、HDV的基因組三、HDV的轉錄、複製與翻譯四、HDV病毒粒子的組裝和釋放基因的克隆與表達

基因克隆(genecloning)基因表達(geneexpression)-原核基因表達

-真核基因表達基因克隆

GeneCloning概述克隆載體受體細胞體外重組的策略基因克隆工作流程一、概述確定了遺傳資訊的攜帶者，即基因的盆子載體是DNA而不是蛋白質揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留複製機理提出了中心法則和操縱子學說，破譯了遺傳密碼1973年Cohen完成第一個基因工程實驗經體外重組獲得雜合DNA雜合子轉化入大腸桿菌所需元件：

限制性內切酶連接酶載體受體細胞基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通過體外重組技術,將一段目的DNA經切割、連接插入適當載體，並導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。

基因克隆的核心-----體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。

基因克隆的技術路線

目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉化受體細胞篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNA二、克隆載體複製基因(replicator)選擇性記號克隆位點三、受體細胞1、定義：外源DNA導入的細胞，是重組體擴增的場所。2、要求：易於接納外源DNA

無特異的內源性核酸內切酶載體複製、擴增不受阻與載體有互補性四、體外重組的策略1、粘末端連接1）全同源粘末端連接最方便簡單高背景-載體自身環化雙向插入2）定向克隆：使外源基因定向插入到載體中的克隆策略粘-粘連接：最有效、最快捷粘-平連接：適用於外源基因僅與載體有一個相同酶切位點，可將另一末端補平2、平末端連接：酶切點為平末端或任何兩個末端補平的DNA效率低，酶用量大3、人工接頭連接人工接頭：人工合成含有酶切位點的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產物的3’端多加一個A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得1、直接分離3、構建cDNA文庫4、PCR5、人工合成6、差異顯示1、直接分離DNA—適用於克隆原核生物的基因組文庫2、構建基因組文庫，篩選目的基因基因組文庫(genelibrary)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，並與合適的載體重組後導入宿主細胞，進行克隆。這些存在於所有重組體內的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。構建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結合法）特點及應用：包含所有遺傳資訊構建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用於研究基因在基因組中的情況3、構建cDNA文庫，篩選目的基因cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細胞中的mRNA為範本，反轉錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內的cDNA的集合即cDNA文庫。cDNA文庫僅包含正在表達的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選4、PCR擴增目的基因片段適用於克隆序列清楚的基因以基因組DNA為範本，直接進行PCR擴增較難多採用以mRNA為範本的RT-PCR法5、人工合成較短的DNA6、差異顯示法(differentialdisplay,DD)—篩選差異表達的基因（二）體外重組連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃

平末端連接：室溫（低於30℃)DNA量：載體分子數/目的基因分子數=1：1-3酶量：平端連接時需加大酶量（三）轉化—Cacl2法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍白斑）原位雜交2、鑒定：長度鑒定：酶切、PCR方向鑒定：聯合酶切測序基因的表達

GeneExpression一．表達系統：基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質的體系，包括克隆載體，表達載體及受體細胞。

據受體細胞的不同可分為：1．原核表達系統：將外源基因引入原核細胞，並使其在原核細胞中以發酵形式快速高效地表達、合成基因產物的體系。2．真核表達系統：使外源基因在真核細胞中表達的體系。二．原核生物基因結構和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環形DNA，其轉錄和翻譯是偶聯的連續進行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結合，翻譯形成多條肽鏈。

3、一般不含內含子（intron），沒有轉錄及翻譯後加工系統

4、原核生物中功能相關的基因串聯在一起，形成操縱子。操縱子（operon）：是一組功能上相關，受同一調控區控制的基因組成的一個遺傳單位

原核生物基因表達的基本單位（即一個轉錄單位）。共同協調作用，完成某一多肽的表達調控。包括：調控區(調節基因，啟動基因，操作基因)、結構基因5、原核生物中參與轉錄的基因結構：啟動子終止子

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結合並啟動基因轉錄的一段DNA序列。

一般長40-60bp，富含A-T堿基對具有保守序列：

-10區（pribnowbox）：TATAAT-35區：

RNA聚合酶識別並結合啟動子，但並不開始轉錄各種啟動子啟動轉錄能力不同。啟動子強弱取決於-35區和-10區的堿基組成及其間隔序列

終止子（terminator，T）:位於基因3’端,給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列6、與轉譯有關的原核細胞結構：——核糖體結合位點轉譯起始密碼子AUG

或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識別與結合序列

三．外源基因在原核表達系統中表達的必要條件：刪除內含子和5’非編碼區外源基因置於強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩定且可有效轉譯，形成的蛋白質不被降解

四．影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：1、啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。

常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負調，受IPTG的誘導Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體CI基因負調控。溫度誘導。2、基因劑量：3、核糖體結合位點：SD順序與16srRNA3’末端互補程度。AUG—SD間距離。AUG後的核苷酸

五．原核表達載體：

適用於在原核細胞中表達外源基因的載體。主要元件：強啟動子

SD順序篩選標誌其他調控基因

類型：融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產物可跨膜分泌至胞周間隙

（一）融合型表達載體

PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因技術關鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構建位相載體----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA載體部分序列DNA序列位相載體----含有3種讀碼框的系列載體優點：表達效率高產物穩定

易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG誘導GST融合蛋白—直接純化產物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因數位相載體融合型載體----pGEX系列（二）非融合型表達載體

PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因主要元件：強啟動子

SD：

ATG：第一個密碼子非融合型表達載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘導插入位點--HpaI（三）分泌型表達載體：1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導蛋白跨膜2、優點：分泌表達，避免降解。

分泌型表達載體----pINIII-ompA1分泌型融合表達載體----pEZZ18六．提高表達水準的手段1、選擇合適載體，提高翻譯水準強啟動子----提高轉錄水準核糖體結合位點（ATG---SD）避免產物降解：分泌/融合表達細菌蛋白酶抑制劑2、選擇合適宿主

Lac啟動子----LacI菌PL/PR--------CI857

溶源菌

3、誘導表達溫度誘導------PLPR/IPTG的化學誘導----Plac、Ptac

4、提高表達蛋白的穩定性，防止被宿主降解七．表達產物的檢測：

1、特異性鑒定：螢光抗體法免疫沉澱法免疫印跡法ELISA2、生物學活性鑒定

八、原核表達系統的缺點1、沒有轉錄後加工系統，不能識別、剪除內含子2、缺乏翻譯後加工系統，不能對翻譯的蛋白質進一步修飾加工真核表達系統的必要性及優勢1.

具轉錄後加工系統2.

具翻譯後修飾系統3.

可實現真正的分泌表達4.基因治療真核基因結構及表達調控特點（一）真核基因組的複雜性真核基因組龐大，具大量非編碼序列---mRNA豐度不同結構複雜：染色質、核膜、線粒體---表達調控多樣不連續性：內含子、外顯子沒有操縱子結構(二）真核表達系統組成：真核表達載體受體細胞基因轉移方式據受體細胞及表達載體的不同分為3種：酵母表達系統哺乳動物細胞表達系統昆蟲細胞表達系統（三）轉化1、原生質體法：去除厚壁2、電穿孔法：效率較高（四）外源基因的表達1、胞內表達2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列（五）缺點不能實現全部的翻譯後修飾功能

基因工程

所謂的遺傳工程就是在分子水準上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遺傳物質，在體外切割、拼接和重新組合。然後通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細胞，使外源ＤＮＡ在受體細胞中進行複製和表達。按人們的需要生產不同的產物或定向地創造生物的新性狀，並使之穩定地遺傳給下一代。所以基因工程（geneengineering）也稱為遺傳工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重組技術（recombinationDNAtechniques）。有時人們還稱它為基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。

遺傳工程的基本操作程式大致包括：目的基因的製備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細胞，克隆轉化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測等。

第一節

基因工程的酶學基礎一、限制性核酸內切酸（restrictionendonuclease）：這類酶又簡稱為限制性內切酶或限制酶（

restrictionenzyme）。限制性內切酶本來是微生物細胞中用於專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防禦機制。根據酶的功能、大小和反應條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內切酶分為三類：

Ⅰ型酶：分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷醯-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，所以在基因工程中應用不大。Ⅱ型酶：分子量較小（105Da），反應只需Mg++的存在，並且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。識別位點是一個回文對稱結構，並且切割位點也在這一回文對稱結構上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ後，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利於ＤＮＡ片段的重組。Ⅲ型酶：這類酶可識別特定順序，並在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。

同裂酶（isoschizomers)：

指來源不同但識別相同靶序列的核酸內切酶。同裂酶進行同樣的切割，產生同樣的末端。但有些同裂、酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：

指來源不同、識別靶序列不同但產生相同的粘性末端的核酸內切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇餘地更大。限制性核酸內切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其他字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數字：表示該菌株發現的限制酶的編號。例：EcoRI:來自於Escheriacoli

RY13的第一個限制酶。二、末端轉移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端去氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反應與DNApolI相似，所不同的是它不需要範本，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達幾百個。末端轉移酶常用於在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結構特徵是含有多種限制性核酸內切酶的酶切位點的回文結構。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內切酶酶切，便可產生粘性末端。這種方法的優點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A三、ＤＮＡ連接酶（DNAligase）

該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來。

DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經退火後能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。

四、反轉錄酶（reversetranscriptase）

這類酶來自於反轉錄病毒，它可以ＲＮＡ為範本，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉錄酶兩種。五、DNApolI及Klenow片段

該酶常用於製備放射性比度比活體標記高得多的ＤＮＡ探針，探針的製備方法是採用所謂的缺口平移（nicktranslation）法制備的。

該酶還用於裂口（gap）修補、反轉錄第二條鏈的合成（

Klenow）、隱蔽末端的填平反應（

Klenow）等。Klenow片段：DNApolI用枯草桿菌蛋白酶水解成兩個片段，小片段（36KD）具有5’3’

核酸外切酶活性，大片段（76KD）稱為Klenow片段，具有DNA鏈聚合及3’5’核酸外切酶的活性。

六、S1核酸酶：

來自於稻穀麯黴，該酶只水解單鏈DNA，用於將粘性末端水解成平末端及cDNA髮夾式結構的處理。七、鹼性磷酸酶：

來自於大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用於脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5’端同位素標記或為了避免DNA片段自身連接（或環化）時可進行脫磷反應。

第二節

目的基因的製備一、化學合成法：

1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。

在體外，可以合成一系列長約幾百ｂｐ的寡聚核苷酸鏈，然後按照基因的順序將這些短的核苷酸鏈連接起來。

化學合成的不足之處在於：（１）要已知基因的核苷酸順序；（２）基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；（３）價格昂貴。

化學合成的最大優點是可以合成一些分離較困難的基因。同時，所合成的基因不含內含子。在原核生物中由於不能進行內含子剪接，所以一旦將含有內含子的基因引入原核生物中表達，其產物往往是沒有活性的。

由於化學合成法有上述一些優缺點，所以這種方法較多地用於合成一些比較小的基因，如某些激素基因。並也取得一些成功的例子，例如胰島素基因，生長激素釋放抑制激素基因等。

由於技術的進步，目前已極少利用化學合成法制備目的基因，而是利用DNA的化學合成法合成一些短的DNA片段作為探針（probe）或PCR的引物。

二、從cDNA文庫或基因組文庫中分離

cDNA文庫及基因組文庫的構造我們將在後面討論，如果製備好了cDNA文庫或基因組文庫，那麼用原位雜交法來篩選（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。將這一克隆子大量繁殖，提取ＤＮＡ，便可獲得所需的目的基因。

必要的時候還可以建立差示文庫（differentiallibrary）。三、ＰＣＲ法：

PCR（polymerasechainreaction)技術是Mullis於1986年發明的一項體外快速大量擴增ＤＮＡ片段的方法（獲1994年諾貝爾獎）。其基本原理就是在體外模擬體內DNA複製的過程，在反應系統中加入欲被擴增的DNA片段，作為範本；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應時，先加熱至約92℃，使範本變性。降溫至約50℃使引物與範本結合（退火），加溫至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ鏈延伸。重複92℃（變性）、50℃（複性）、72℃（延伸）的過程使ＤＮＡ片段得到不斷的擴增，可以重複幾十個週期。ＤＮＡ片段將2n（ｎ為反應週期數）的倍數增加。四、mRNA差別顯示分離目的基因

根據表達特徵，真核細胞的基因可以分為兩類：一是所謂的看家基因（house-keepinggene），另一類是發育調控基因（developmentalregulatedgene）。

在不同的生長時期、在個體的發育與分化的不同階段、在生物體對外界環境的壓力的反應、在個體的衰老與死亡等不同的環境下發育調控基因的表達是不同的，這就是基因的差別表達（differentialexpression）。mRNA的差別顯示技術就是用來分離這些差別表達的基因的一項有用的技術。

該技術是P.Liang&A.D.Pardee1992年建立的，全稱為mRNA差別顯示PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)原理：該技術是利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴設計。根據mRNA結構分析知道，polyA尾巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：根據這12種排列組合，設計12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由11~12個T及兩個其他的堿基組成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。5’端引物：5’端為10個堿基（10-mer）組成的隨機引物。每一個隨機引物都可能與總mRNA中的某一些分子發生雜交，雜交位點也可能在mRNA的不同位點上。用一種3’錨定引物和一種5’隨機引物進行擴增，可獲得50~100條100~500bp的DNA擴增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5’隨機引物。第三節

基因工程載體

載體（ｖｅｃｔｏｒ）是由在細胞中能夠自主複製的ＤＮＡ分子構成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其他的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進行複製，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：

分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。能獨立於染色體而進行自主複製並且是高效的複製。要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點。有適合的標記，易於選擇。有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，並且盡可能是高效的表達。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限於在某些實驗室內特殊菌種內才可複製等等。

一、質粒（plasmid）載體

質粒是一種獨立於染色體外的小分子環狀ＤＮＡ，一般大小約106~108D，可自身複製和表達，有的質粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因，所以質粒經過適當改選後便可成為良好的載體。

作為載體的質粒大多是由天然質粒經人工適當改造而成的，目前已有多種經改造的良好的質粒載體。以Ampr和Tetr為選擇性標記，克隆位點在這兩個選擇性標記的單酶切位點上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）pUC系列：

是目前最常用的E.coli質粒載體。包括pUC7、

pUC8、

pUC9、

pUC12、

pUC13、

pUC18、

pUC19、pUC118、pUC119等。優點：分子量更小，拷貝數更高：分子量在3KB左右，拷貝數可達每細胞500~700個，因此不需要氯酶素擴增。引入多克隆位點（multiplecloningsites,MCS）方便操作。引入lacZ’基因方便篩選。篩選原理——α互補——蘭白篩選：

LacZ’是lacZ基因的突變型，編碼半乳糖苷酶N端的146個氨基酸（全長1201氨基酸）。MCS也在這個區域內。這類載體的適合宿主細胞必須是Z基因突變型，只具有Z基因C端的序列。當兩個Z基因的突變產物在一起時可產生蛋白質間的互補，稱α互補。

具有α互補的細菌培養在含IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養基上會形成的蘭色菌落。相反，不互補則產生白色的菌落。X-gal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產生蘭色的物質（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此菌落為蘭色。如果在MCS位點上插入DNA片段導致插入突變，則不能產生α互補，因此菌落是白色的。

IPTG起誘導表達的作用，相當於乳糖，但它的誘導效率遠高於乳糖。原核表達載體：pGEM系列包括pGEM-3、

pGEM-3Z、

pGEM-3Zf（-）、

pGEM-4、

pGEM-4Z等。帶有噬菌體編碼的RNA聚合酶啟動子SP6及T7啟動子，可用於外源基因的表達。pGEX系列：

包括pGEX-1、

pGEX-1λT、

pGEX-2T、

pGEX-3X等。該系列是一類融合表達載體，在克隆位點上游有一個穀胱甘肽巰基轉移酶（glutathioneS-transferase，GST）基因的一個片段。融合位點上有特異蛋白酶水解位點，方便GST的去除。在GST上游有一個啟動子Ptac（trp操縱子啟動子與lac操縱子啟動子的融合啟動子），在IPTG誘導下表達。二、噬菌體（bacteriumphage,phage）載體：1、λ噬菌體載體：λ噬菌體的基因組結構：AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

頭部基因

尾部基因

功能不明區

溶原化

重組

早期控制

阻遏

DNA合成

溶菌生長非必須區段cI基因：溶原過程控制基因，插入式載體：λ噬菌體載體相對於質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用於cDNA文庫或基因組文庫的構建。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入後將導致cI基因的失活。cI基因失活後將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活後利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

由於λ噬菌體包裝時，只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，所以插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較取代式為小。

cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A取代式載體：野生型噬菌體染色體的中段對於噬菌體的感染和複製是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon4A、

λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區段，同時將Lac5作為選擇標記，使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而後，感染E.coli使之在E.coli內繁殖，並裂解E.coli，形成空斑。

Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40（左右臂連接）

（三段自身連接）

（插入片段）

為避免載體自身連接產生的假陽性，可採用雙酶解的方法。例如：