酶分子的化学修饰

第五章酶分子的化学修饰

酶分子化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，以达到改构和改性的目的。在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学物质，特别是一些有生物相容性的物质进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。这些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。酶化学修饰的应用领域在基础酶学研究上探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶的作用机理与催化反应历程酶纯度的分析与检测在疾病治疗上克服酶在体内的不稳定性消除或降低酶的抗原性在工业上的应用酶稳定性提高，使生产成本降低反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。主要研究内容第一节酶分子的化学修饰方法第二节酶化学修饰的基本要求第三节修饰酶的化学性质第一节酶分子的化学修饰方法一、酶的表面修饰（一）化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。（二）酶的小分子修饰作用：主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。（三）酶的大分子修饰作用：可分为非共价修饰和共价修饰两大类：1、大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。2、大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。PEG是线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性，被广泛用于酶的修饰。PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降等。（四）分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。（五）脂质体包埋：一些医药用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。（六）反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性。

加H2O

疏水尾部

亲水头部

加酶液

S

PEEE

图：反相胶团的结构和酶的分布二、酶分子的内部修饰（一）非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分水解，可以改变酶的催化特性。（三）催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。（四）肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠。三、与辅因子相关的修饰对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因子共价结合于酶分子上；引入新的具有更强反应的辅因子。四、金属酶的金属取代酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变酶的专一性、稳定性等。第二节酶化学修饰的基本要求一、掌握被修饰酶的性质1、酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。2、酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活力回收要高。1、pH与离子强度：pH决定了酶分子中反应基团的解离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不同；另一方面，有些修饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。2、修饰反应的温度与时间：严格控制反应温度和时间可以减少或消除一些非专一性的修饰反应。3、反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。第三节修饰酶的化学性质一、热稳定性：

一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性。天然酶和修饰酶的热稳定性比较

酶

修饰剂

修饰酶

天然酶

处理条件(℃/时间)

残留酶活(%)酰苷脱氢酶

胰蛋白酶

过氧化氢酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEP和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脱氢酶Arg酶过氧化氢酶胰蛋白酶抗原性修饰剂-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除修饰酶的抗原性变化三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高。天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶抗抑制剂抗蛋白酶修饰剂抗失活剂过氧化氢酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂——抗尿素抗SDS四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长。天然酶与修饰酶的半衰期比较酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶修饰剂半衰期天然酶修饰酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，这在应用上具有重要意义。天然酶与修饰酶的最适