全基因组血清miRNAs表达分析筛选阿尔茨海默病血清生物标志物的研究

全基因组血清microRNAs表达分析筛选阿尔茨海默病血清生物标志物的研究阿尔茨海默病(AD)是引起老年痴呆疾病最常见原因,约占59%；痴呆已成为威胁人类健康的“第三大杀手”；国际AD现状:“三高”：患病率高、致残率高、负担高；“三低”：就诊率低、诊断率低、治疗率低；我国65岁以上人群AD患病率为3.21%，85岁以上达20%。【Lancet.2013】【Alzheimer's&Dementia.2013】研究背景AD患者数量未来50年将增长3倍！AD发病、诊断的现况与问题AD是由遗传因素与环境因素共同作用的多基因复杂性疾病。——AD发病机制不清？现仍缺乏有效防治手段。AD临床特点对疾病诊断治疗的帮助仅为冰山一角！——确切诊断只能依靠脑组织活检或者证实染色体突变。AD的早期诊断对治疗至关重要。——临床上急需易于检测的早期预警和诊断的生物标记物。【Neurology.2012】【LancetNeurol,2003】【ExpGerontol.2010】研究AD发生发展的分子进程将极大促进AD的诊断和治疗！【Alzheimer's&Dementia.2011】新的AD诊断指南已纳入生物标志物相关内容AD现有生物标志物特点脑脊液检查

总tau蛋白、Aβ42、高度磷酸化tau蛋白

特点：创伤较大，取材不方便

影像学检查

功能性MRI、淀粉蛋白成像PET、特定部位MRI

特点：价格昂贵血液学检查

蛋白、抗体、microRNA…

特点：非侵入性、取材方便、花费少…【Alzheimer's&Dementia.2013】miRNA是一种非编码单链小分子RNA。以碱基互补配对方式结合到靶基因mRNA的3’非翻译区。一种miRNA调控多个靶基因参与基因的转录和表达调控来调控各种蛋白。microRNA:一种新型生物标志物mRNAOnemiRNAmRNAmRNAmRNAmRNA…同一基因组不同蛋白基因组蛋白质表观遗传DNA甲基化

组蛋白修饰miRNA...miRNA作用机制：调控大部分基因组的表达miRNA在AD中作用机制miRNAs是一类可以调节mRNA翻译和降解的非编码RNA。遗传和表观遗传改变可能影响脑组织miRNA表达，从而导致AD相关基因的特异性表达。研究表明，血浆或脑脊液中某些候选miRNAs可作为AD的潜在生物标志物。【CellMolLifeSci.2012】【JAlzheimersDis.2014】【Aging.2013】【ExpNeurol.2012】传统候选基因法

vs

高通量测序推论和疑问现有研究表明：特异性差异表达的血清miRNAs有可能成为新的AD早期预警和诊断生物标记。高通量筛选和鉴定AD特异性血清miRNAs表达差异谱的迫切提出以下疑问：血清miRNA表达谱能否作为诊断AD的生物标志物？

研究方案初筛复筛验证AD=50HC=50AD=50HC=50AD=158HC=155步骤

纳入对象

方法高通量测序荧光定量PCR荧光定量PCR第一步：高通量血清microRNAs全基因组测序

数据分析与正常对照相比，AD患者血清miRNAs拷贝数大于10且变化2倍以上认为有意义IlluminaHiSeq2000测序

血清

提取miRNA

-800C贮存

混合血清HC

ADTrizol试剂

第二、三步：荧光定量PCR复筛、验证miRNA

数据分析变化倍数>1.5倍P<0.05CQ<

35至少在75％的样本能够被检测CFX96RT-PCR定量PCR测定

血清

提取miRNA-800C贮存

单个血清HC

AD纳入研究样本的基本信息研究结果

血清miRNA高通量测序结果血清中miRNA长度约19-24nt（图①）血清中miRNA种类占所有小RNA种类最多（图②）血清中miRNA含量占所有小RNA含量最多（图③）①②③高通量测序后筛选出14种差异性表达的miRNA小样本复筛后筛选出12种差异性表达的miRNA大样本验证后筛选出6种差异性表达的miRNA6种差异性表达的miRNA的ROC曲线代表该miRNA敏感度、特异度最高6种差异性表达的miRNA的ROC曲线数据代表该miRNA曲线下面积最大miR-342-3p可作为潜在AD生物标志物miR-342-3p作为AD诊断性标志物

敏感度：81.5%；特异度：70.1%MMSE与miR-342-3p呈相关性即：miR-342-3p相对含量越低，患者MMSE评分越低。

相关系数r=-0.562,P<0.0001首次运用生物信息学方法预测与AD相关的miRNAs靶基因。6种差异性表达的miRNA与AD相关的靶基因位点代表6种miRNA代表每种miRNA的靶基因位点miR-342-3p作用的与AD相关的靶基因位点………信息库：/pubmed/

/讨论AD起病过程隐袭，在患者出现严重认知功能障碍等临床症状前，其血液中部分标记物已出现特征性变化。近年来AD生物学标记物的研究已成为研究热点。（篇）pubmed上1982年至2014年关于AD生物标志物已发表的文献数量。血清miRNA近年来成为AD标志物研究热点：

——血清样本易得并且成本小，为非侵入性检测指标；——miRNA较蛋白稳定，受外界环境干扰比较小；2012年，Geekiyanage等应用荧光定量PCR技术检测7例AD患者和7例健康对照外周血清中5种miRNA（候选基因法）的表达水平。2012年，Sherman等纳入20名MCI和20名健康对照，采用候选miRNAs的研究策略，探讨了血浆中32种候选miRNA用于MCI诊断的可行性。【ExpNeurol.2012】【Aging.2012】样本量大小和地域差异可导致研究结果不同。国内关于AD生物标志物的研究有限，大多数集中于AD大鼠模型脑组织miRNA的研究。高通量测序检测的表达谱包含血清所有miRNA，能够克服传统候选基因策略带来的一些假阳性干扰，提高检测的灵敏性和可信度。我们首次提出运用高通量筛选和鉴定AD特异性血清miRNAs表达差异谱并作为AD生