实验一胰岛学样生长因子菌种的制备

实验一胰岛素样生长因子-1菌种的制备 (IGF-1)一、 实验目的了解发酵工业菌种的制备工艺和质量控制，并为发酵实验准备菌种。二、 实验原理菌种制备的主要手段是扩培，其出发点就是尽可能培养出高活性能满足大规模需要的纯种。由于现代生产菌种的生产性能已非常高，因此，其自发突变往往以负向突变为主，加上平时操作中有可能污染，菌种很容易退化，所以菌种的管理非常重要，管理方式主要有两点：一是分纯，二是扩培。分纯是为了保证菌种的性能稳定，一般每2个月左右就应分纯一次。菌种分享纯化一般分两步进行。第一步是平板稀释分离，目的是分离出单细胞菌落。具体方法是把待分离的菌株用无菌生理盐水做成菌悬液，并在装有玻璃珠的三角瓶中充分振荡(可以放在摇床上振荡20-30min)，利用玻璃的滚动，使菌体细胞分散，然后将菌悬液稀释成一定的浓度，分别作平板培养，使被分离的单细胞长成单菌落。第二步是挑若干单菌落移接于平板上，然后把这些菌株分别用三角瓶进行摇瓶发酵试验。菌种扩培的顺序是：平板培养基菌种、一级种子、二级种子。.平板培养基菌种一般于37。。培养12h。每批菌种培养完成后，要仔细观察菌落生长情况，菌落的颜色各边缘等特征是否正常，有无感染杂菌的征象。对质量有怀疑的应坚决不用。平板菌种应保存于冰箱中。生产中使用的平板菌种不宜多次移接，一般只移接3次(3代)，以免由于菌种的自然变异而引起菌种退化。因此，有必要经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的平板培养菌株供生产使用。.一级种子通常用试管进行液体振荡培养。一级种子的培养条件：每支试管中装入5皿1液体培养基，瓶口用6-8层纱布包扎，0.1MPa的蒸汽压力下灭菌30min，平板挑单菌落接种到试管培养基中。3.二级种子使用三角瓶培养。一般二级种子的数量是按发酵培养液体体积的1%来确定。近来由于发酵工艺的改进，接种量有不断加大的趋势，甚至有达到10%的工艺。二级种子培养时间一般为3-4h种子培养成熟后，需要检验其质量。三实验器材：试管、三角瓶、高压灭菌锅、摇床。四实验步骤1平板培养基的制备将平板清洗干净，晾干并且4个一组包扎好，放于高压灭菌锅中空消，空消条件为0.1Mpa20min配制LB固体培养基酵母粉5g/L蛋白胨10g/L氯化钠5g/LpH7.2加入2%琼脂粉在0.1Mpa20min灭菌后等温度降到40度左右，培养基中加入80ug/ml卡那霉素。然后倒平板.将倒好的平板在37度恒温培养箱中培养24h，检查无菌后备用。将菌株采用接种环划线到平板固体培养基中，过夜培养。待用2一级种子的制备一级种子培养的目的在于制备大量高活性的菌体，其培养基配方同上(无琼脂粉)将配好培养基分装到150ml三角瓶中，高温灭菌后，冷却，挑在平板培养基上长出的单菌落，放于LB试管培养基中，在37度180r/min进行培养，8-12h，待OD为0.8时，可转二级种子。3二级种子的制备配方同上，0.1mpa20min灭菌后，冷却后接种，接种量为2%-5%摇床培养3-4h实验二发酵罐的构造及空消一、 实验目的.了解发酵罐的罐体构造和管道系统。.掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。二、 实验原理发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前，必须先对发酵罐进行空消。微生物虽然是一个复杂的高分子体系。但受热死亡是由于蛋白质变性所致。在一定温度下微生物热死遵循分子反应速度理论。即微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比，这称为对数残留定律。三、 实验器材蒸汽发生器、发酵罐及控制系统、空气压缩机。四实验步骤思考题：画出发酵罐的平面图，并说明各个部件的作用。说明发酵罐的灭菌步骤？实验三IGF-1发酵及控制一、 实验目的了解发酵罐的操作，完成IGF-1发酵的全过程操作。二、 实验原理本次实验涵盖了发酵罐的实消、配料、接种及发酵控制等主要操作。（一） 发酵培养基的灭菌发酵培养基的灭菌受许多因素的影响。培养基PH对微生物的耐热性影响大，PH6.0-8.0时，微生物最耐热，偏酸或偏碱使H+或HO-渗入微生物细胞内，促使其死亡；培养基成分也会影响灭菌效果，高浓度的有机物会在细胞周围形成一层保护膜，影响热的传入，所以培养基中存在油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性，需将灭菌温度升高或时间延长；对于含固形物多的培养基，灭菌温度应适应提高，一般颗粒小于1mm时，对灭菌影响不大，但颗粒大时，杂菌包于其间难于被杀死，应提高灭菌温度或将颗粒过滤除去。另外，含大量蛋白质和淀粉的培养基容易起泡沫，泡沫中的空气形成一隔热层，使热量难于穿透进去，影响灭菌效果，因此应加少量消泡剂以消除泡沫。在灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随关培养基成分的破坏，尤其是氨基酸、维生素、葡萄糖等成分，从而引起发酵产品的减产。随着温度的上升，菌死亡速率大于养分破坏速率。所以要达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基养分的破坏程度。根据这一原理，目前常用高温短时间来对培养基进行灭菌。（二） 灭菌方式本实验用分批灭菌，即将培养基置于发酵罐中，用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一段时间，再冷却到发酵温度，然后接种进行发酵，这种灭菌又叫实罐灭菌。特点是原料的灭菌和微生物的发酵在同一罐中进行。优点为①设备简单，不需要要专门的灭菌设备②操作简单易行。缺点为①加热和冷却所需的时间长，降低了发酵罐的利用率，使生产周期延长；②无法采用高温短时间的灭菌方法。适应范围是①规模较小的发酵罐；②起泡性强、黏度大和含固形物多的培养基。三实验器材蒸汽发生器、发酵罐及控制系统空气压缩机四实验步骤可参考实验指导书p88步骤但是培养基配方和实消操作步骤不一样实验四发酵过程中间分析见发酵批报一、 残糖检测实验原理游离的寡糖和多糖中的已糖、戊糖及其糖醛酸经浓硫酸脱水生成糖醛或羟甲基糖醛酸，生成物可与酚类化合物缩合产生有色物质，已糖的生成物于490nm\、戊糖及糖醛酸的生成物在480nm波长处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系，用比色法可测定糖含量。二、 试验用品（一） 器材（1） 电炉（2） 水浴锅（3） 722分光光度计。（二） 试剂（1） 75%、95%乙醇。浓硫酸：分析纯，95.5%。（2） 80%苯酚：80g（分析纯、重蒸馏试剂）加20ml蒸馏水使之溶解。可置冰箱中避光长期保存。（3） 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（4） 葡萄糖（或葡萄糖）标准溶液：准确称准葡聚糖或经干燥恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容到刻度，即含糖为100gg/mLo（三） 材料IGF-1发酵液。三、 实验程序（一）操作方法葡聚糖（或葡萄糖）标准曲线制作取6支塞试管，分别加入100gg/mL糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，各补加蒸馏水至1.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL,浓H2SO45.0mL,摇匀静置10min后，在25-30°C水浴中放置20min，于490nm波长处测光吸收值，以1.0mL蒸馏水代替糖标准液，按同样步骤操作为空白调零。以糖含量（pg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，