(完整版)VC标准曲线

药用的维生素c是人工合成的。合成的方法有多种。一般是由葡萄糖制成D-山梨醇，再用黑乙酸菌（AcetobacterSuboxydans)氧化发酵，生成L-山梨糖，经缩合生成二丙酮-L-山梨糖，再氧化生成二丙酮-2-酮-L-葡萄糖酸，然后酯化成2-酮-L-葡萄糖酸甲酯，与甲醇钠作用生成抗坏血酸钠，与盐酸加热制成抗坏血酸。所以它指的就是你的Vc含量，严格意义上来讲是L-抗坏血酸。通常抗坏血酸总量被认为是维生素C(VitaminC,VC)和其氧化形式二十二碳六烯酸(docosahexaenoic_acid,DHA)的总和2,4-二硝基苯肼比色法

8原理

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸,样品中还原型抗坏血酸经活性炭

氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,根据脎在硫酸溶液中的含量

与总抗坏血酸含量成正比,进行比色定量。

9试剂

本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。

9.14.5mol/L硫酸:谨慎地加硫酸(比重1.84)250mL于700mL水中,冷却后用水稀释至

1000mL。

9.285%硫酸：谨慎地加900mL硫酸(比重1.84)于100mL水中。

9.32%2,4-二硝基苯肼溶液:溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸内,过滤。

不用时存于冰箱内,每次用前必须过滤。

9.42%草酸溶液:溶解20g草酸(H2C2O2)于700mL水中,稀释至1000mL。

9.51%草酸溶液:稀释500mL2%草酸溶液到1000mL。

9.61%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500mL1%草酸溶液中。

9.72%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500mL1%草酸溶液中。

9.81mol/L盐酸:取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200mL。

9.9抗坏血酸标准溶液:溶解100mg纯抗坏血酸于100mL1%草酸中,配成每毫升相当于1mg

抗坏血酸。

9.10活性炭:将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中,回流1～2h,过滤,用水洗数次,

至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,然后置于110℃烘箱中烘干。

检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述

洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。

10仪器和设备

10.1恒温箱：37±0.5℃。

10.2可见-紫外分光光度计。

10.3捣碎机。

11操作步骤

11.1样品的制备

全部实验过程应避光。

11.1.1鲜样的制备:称100g鲜样和100g2%草酸溶液,倒入捣碎机中打成匀浆,取10～40g

匀浆(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。

11.1.2干样制备:称1～4g干样(含1～2mg抗坏血酸)放入乳钵内,加入1%草酸溶液磨成匀

浆,倒入100mL容量瓶内,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。

11.1.3将(11.1.1)和(11.1.2)液过滤,滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后,

倾出上清液,过滤,备用。

11.2氧化处理：取25mL上述滤液,加入2g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升

滤液。取10mL此氧化提取液,加入10mL2%硫脲溶液,混匀。

11.3呈色反应

11.3.1于三个试管中各加入4mL稀释液(11.2)。一个试管作为空白,在其余试管中加入

1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液,将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中,保温3h。

11.3.23h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温,

然后加入1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤

同样品。

11.485%硫酸处理：当试管放入冰水后,向每一试管中加入5mL85%硫酸,滴加时间至

少需要1min,需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出,在室温放置30min后比色。

11.5比色：用1cm比色杯,以空白液调零点,于490nm波长测吸光值。

11.6标准曲线绘制

11.6.1加2g活性炭于50mL标准溶液中,摇动1min，过滤。

11.6.2取10mL滤液放入500mL容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度,抗坏血

酸浓度20μg/mL。

11.6.3取10、20、30、40、50mL稀释液,分别放入5个50mL容量瓶中,用1%硫脲溶液

稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为4、8、12、16、20μg/mL。

11.6.4按样品测定步骤形成脎并比色。

11.8.5以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。

12计算

c•V100

X=━━━━━×F×━━━━............................(2)

m1000

式中：X─—样品中总抗坏血酸含量,mg/100g;

c─一由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度,μg/mL；

V─—试样用1%草酸溶液定容的体积,mL；

F──样品氧化处理过程中的稀释倍数；

m──试样质量,g。

13空白：0.062±0.00554μg/mL0.1628μg/mL0.24312μg/mL0.36016μg/mL0.44620μg/mL0.532线性方程：Y=0.0233X+0.0039R2=0.9978一、原理还原型抗坏血酸（AsA）可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反应形成红色螯合物。在534nm波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。二、仪器与用具离心机；分光光度计；研钵；试管。三、试剂5%三氯乙酸（TCA）；无水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液（请注意结晶水合物需要扣除结晶水含量，试剂浓度不在99%以上的需要换算成实际质量）四、步骤1.制作标准曲线配制浓度为，1mg/L，2mg/L，4mg/L，8mg/L，10mg/L，15mg/L，25mg/L的AsA系列标准液。25mg/L抗坏血酸：准确称取2.5mg抗坏血酸溶于水定容至100mL容量瓶。15mg/L抗坏血酸：从25mg/L抗坏血酸溶剂中吸取15mL定容至25mL10mg/L抗坏血酸：从25mg/L抗坏血酸溶剂中吸取10mL定容至25mL8mg/L抗坏血酸：从25mg/L抗坏血酸溶剂中吸取8mL定容至25mL4mg/L抗坏血酸：从25mg/L抗坏血酸溶剂中吸取4mL定容至25mL2mg/L抗坏血酸：从25mg/L抗坏血酸溶剂中吸取2mL定容至25mL1mg/L抗坏血酸：从25mg/L抗坏血酸溶剂中吸取1mL定容至25mL取各浓度标准液1.0ml于试管中，加入1.0ml5%TCA、1.0ml乙醇摇匀，再依次加入0.5ml0.4%H3PO4－乙醇、1.0ml0.5%BP－乙醇、0.5ml0.03%FeCl3－乙醇，总体积5.0ml。将溶液置于30℃下反应90min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。2.提取取植物叶片1.0g，按1∶5（W/V）加入5%TCA研磨，4000r/min离心10min，上清液供测定。在氮气保护中研磨且避光做不到，也可直接超声10min后取上清液测定，最好能过滤或离心。3.测定（1）AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，