第16章中药制剂和生化药物分析简介

第十六章中药制剂和生化药物分析简介定义：中药制剂是根据中医药理论和用药原那么，将单味或多味中药材按规定的处方和方法加工制成具有一定规格，可以直接用于防病、治病的单方或复方制剂。中药的成方制剂又称为中成药。第一节中药制剂分析简介

注意：中药制剂分析必须是以中医药根底理论和用药原那么为指导运用现代分析理论和方法进行的质量分析。二、中药制剂分析的特点1、有效成分的难确定性

中医药理论：整体观念协同作用质量分析：根据中医药理论进行综合分析2、化学成分的多样性与复杂性〔1〕每一味中药本身就是一个混合物：人参：仅人参皂苷类成分就有几十种之多；还有多糖、挥发油等成分。〔2〕化学成分之间的相互影响：黄连黄芩、甘草、金银花配伍小檗碱能和黄芩苷、甘草酸、绿原酸形成难溶于水的复合物而沉淀析出3、中药制剂原料药材质量的差异〔1〕原料药材的品种、规格、产地、药用部位、采收季节、加工方法的影响

GAP中药材生产质量管理标准麻黄东北→西北〔-〕麻黄碱含量↑〔+〕麻黄碱含量↓丹参酮：11、12月份含量最高薄荷脑：秋季叶变黄时含量最高葛根：野葛不得小于2.4%粉葛不得少于0.3%葛根素含量差异很大不同部位人参皂苷的含量重量比(%)总皂苷含量(%)周皮6.92.60韧皮46.63.04木质部46.50.31〔2〕炮制方法的影响

草乌：酯型生物碱的含量与炮制条件有关延胡索：醋制，醋的浓度对总生物碱的溶出率有较大影响4、评价中药制剂质量，应以中医药

理论为指导原那么中药制剂的组方有君、臣、佐、使之分；质量分析〔1〕着重分析君药、臣药；贵重药、剧毒药。例：黄连上清丸：黄连是主药安宫牛黄丸：黄连是辅药〔2〕中医临床功能主治与现代药理学相结合进行分析例：山楂：健胃消食制剂中测有机酸含量活血止痛治疗心血管疾病测黄酮类成分丸、散、片、锭、合、酒、酊、膏、露、茶、栓、颗粒、糖浆等5.中药制剂工艺及辅料的特殊性〔1〕剂型繁多，制备工艺各异有效成分与浓缩枯燥方法的关系(%)常压减压逆浸透成分浓缩浓缩喷雾大黄酸葡萄糖苷41.151.696.8小檗碱34.537.594.5黄连碱6.312.093.7黄岑苷77.477.698.5三黄泻心汤干浸膏

针对不同的剂型，采用相应的方法进行别离纯化后测定〔2〕辅料种类多，干扰大蜡丸蜂蜡蜜丸蜂蜜糊剂糯米粉、黄米粉曲剂发酵胶剂豆油、黄酒、冰糖6、中药制剂杂质来源的多途径性7、中药制剂有效成分的非单一性中药制剂的分类二、中国药典〔2000年版〕一部〔二十六种〕丸剂胶剂膏药颗粒剂滴眼剂散剂合剂露剂糖浆剂软膏剂片剂酒剂茶剂滴丸剂注射剂锭剂酊剂搽剂胶囊剂滴鼻剂栓剂巴布膏剂橡胶膏剂气雾剂喷雾剂煎膏剂〔膏滋〕流浸膏剂与浸膏剂（一）液体制剂用药材提取物制备的液体制剂合剂、糖浆剂、酒剂、茶剂、酊剂滴鼻剂、滴眼剂、露剂、搽剂等〔无植物组织与细胞，故无显微鉴别〕1、合剂与口服液〔单剂量合剂也可称为“口服液〞〕pH装量相对密度微生物限度一般检查项目合剂系指药材用水或其他溶剂，采用适宜方法提取，经浓缩制成的内服液体制剂2、酒剂与酊剂酒剂酊剂含乙醇量（GC）甲醇量检查（GC）总固体装量微生物限度一般检查项目药材用蒸馏酒提取制成的澄清液体制剂药物用规定浓度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液体制剂（二）半固体制剂软膏装量微生物限度检查项目常用基质油脂性、水溶性乳剂型〔乳膏剂〕药物、药材细粉、药材提取物与适量基质混合制成的半固体外用制剂药材提取液的浓缩液（三）半流体制剂煎膏剂(膏滋)流浸膏剂与浸膏剂〔半流体或固体〕〔无植物组织与细胞，故无显微鉴别〕药材用水煎煮、去渣浓缩后，加炼蜜或糖制成的半流体制剂1、煎膏剂(膏滋)相对密度不溶物装量微生物限度检查项目应无焦臭、异味，无糖结晶析出2、流浸膏剂与浸膏剂（半/固）药材用适宜的溶剂提取，蒸去局部或全部溶剂，调整浓度至规定标准而制成的制剂装量微生物限度检查项目1ml流浸膏——1g原药材1g浸膏——2~5g原药材生产提取溶剂大多为水或稀醇检测时一般需经有机提取后分析〔1〕有效成清楚确且有适当方法，测定有效成分的含量〔2〕有效成分不明或无定量方法的，可测一定溶剂的浸出物含量〔3〕对于流浸膏，有的测总固体量以控制其质量（四）固体制剂药材提取物、药材粉末加赋形剂、制备而成丸剂、胶剂、颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、锭剂、胶剂、茶剂、栓剂〔有植物组织与细胞，可做显微鉴别〕三、中药制剂分析的一般程序及方法取样鉴别含量测定检查提取纯化〔一〕取样原那么：均匀合理方法：〔1〕抽取样品法：样品量大〔2〕圆椎四分法：样品量小供试品溶液的制备（二）1、提取方法（1）萃取法利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使物质从一种溶剂转移到另一种溶剂中，将测定组分提取出来的方法正丁醇——用于皂苷类醋酸乙酯——用于黄酮类氯仿——用于生物碱类乙醚、石油醚——用于挥发油1〕萃取溶剂的选择2〕水相pH的选择酸性成分——比其pKa低1~2个pH单位碱性成分——比其pKa高1~2个pH单位〔3〕仪器和提取次数〔4〕酒剂和酊剂——先挥去乙醇〔5〕防止和消除乳化分液漏斗鉴别——1次含量测定——3~4次（2、）冷浸法样品置溶剂里，室温下浸泡一段时间的提取方法适宜易溶出的组分适宜遇热不稳定的药物费时（8~24小时）特点适用范围适宜植物性粉末不宜动物性粉末亲脂性←→亲水性石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水（3）回流提取法样品置有机溶剂中加热回流的提取方法加快溶出速度，省时适宜受热稳定的药物适宜较难溶出的组分特点仪器普通回流装置通过更换溶剂，使提取更完全（4）、连续回流提取法样品置有机溶剂中加热，蒸发的溶剂经冷凝流回样品管的提取方法节省溶剂，提高提取效率适宜受热稳定的药物费时特点仪器索氏提取器（5）、水蒸气蒸馏法适用于具挥发性的可随水蒸气蒸出的组分的测定麻黄碱、槟榔碱、丹皮酚、挥发油（6）、超声提取法超声波振荡器〔超声波清洗器〕简便省时提取率高

利用超声波的助溶作用进行提取原理超声波在液体中以疏密相间的形式向物体辐射，出现“空化〞现象〔气泡的形成、产生及破裂现象〕，形成超过1000个大气压的冲击力（7）、超临界流体萃取〔SFE法〕当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态超临界流体是一种处于超临界点之上的流体，是介于气体与液体之间的一种物相，兼有气体与液体的一些特性气体超临界流体气体T↓压力↑T↑压力↓超临界流体萃取与化学法萃取相比有以下突出的优点：1〕它具有与液体相似的密度，因而具有与液体相似的较强的溶解能力；2〕溶质在流体中的扩散系数与气体相似，具有传质快，提取时间短的优点；3〕超临界流体的外表张力为零，易渗透到样品中，带走测定组分；4〕超临界流体在通常状态下为气体，萃取后溶剂可立即变成气体而逸出，易到达浓集的目的；5〕CO2是一种不活泼的气体,萃取过程不发生化学反响,且属于不燃性气体,无味、无臭、无毒，故平安性好；6〕CO2价格廉价，纯度高，容易取得，且在生产过程中循环使用，从而降低本钱；7〕该技术易与其他仪器联用实现自动化2、纯化方法〔1〕、萃取法利用药物与杂质溶解性能的不同进行别离例生物碱盐氨水H2O〔2〕柱色谱法〔1〕保存测定组分在柱上，洗去杂质，再用适当溶剂洗下组分〔2〕保存杂质于柱上常用固定相硅胶氧化铝大孔吸附树脂鉴别试验〔三〕、首选有效成分黄连小檗碱〔抗菌消炎〕麻黄麻黄碱〔支气管哮喘〕乌头乌头碱〔毒性〕洋地黄强心苷〔强心〕延胡索延胡索乙素〔镇痛〕1、显微鉴别〔含生药粉制剂〕丸剂、片剂、胶囊剂、散剂快速，简便，覆盖面大选择原则（1）应选有专属性的特征进行鉴别（2）多来源的药材应选择共有的特征进行鉴别1、水牛角浓缩粉2、麝香3、珍珠4、朱砂5、雄黄6、黄连7、栀子8、郁金9、黄芩安宫牛黄丸2、化学鉴别抗干扰能力差显色、↓、↑、荧光例二妙丸中苍术的鉴别苍术酮苍术炔3、色谱鉴别TLC法——应用最多〔Rf、颜色、荧光〕GC法——适用于含挥发性成分的药物HPLC法——常与含量测定同时进行〔1〕阴、阳对照法阳性对照将要鉴别的药材按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液阴性对照把制剂中要鉴别的药材除去，用剩下的各味药按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液

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阴样阳对品对例大补阴丸黄柏的TLC法鉴别样品对照药材小檗碱O

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例〔2〕对招品对照法〔3〕对照药材对照法薄层板的选择硅胶G板〔可加0.3%~0.5%CMC-Na〕——多用氧化铝板——常用于生物碱类药物聚酰胺板——常用于黄酮类及酚类药物纤维素板——常用于氨基酸类药物〔1〕定义：中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标定该中药材或中药制剂特性的共有峰的图谱4、中药鉴别新技术－中药指

纹图谱〔2〕.色谱指纹图谱的根本属性整体性将指纹图谱作为一个整体来分析和比较它的综合特征以到达鉴别的目的。模糊性强调分析、比较指纹图谱的相似性，而不是完全相同。是一种综合的、量化的色谱鉴别手段。色谱指纹图谱在中药质量评价中能够尽可能多地反响中药的全貌。不需要清楚每一个组分的化学结构；不需要对每一个组分都进行定量；只要求不同批号的同一种药品的指纹图谱保持一致。〔3〕.指纹图谱的应用雅莲云莲味莲雅莲云莲IIIIII诃子小诃子大诃子绒毛诃子人参须根人参主根不同产地高良姜的气相指纹图谱指纹图谱研究过程中的本卷须知：1、在药效学指导下进行研究，保证指纹图谱反映的化学成分包括中药材中有效部位所含的绝大局部成分或有效成分的全部。2、样品的预处理过程及测定方法应简便、经济、易行，且专属性、准确度与重现性好。杂质检查（四）、水分总灰分和酸不溶性灰分重金属砷盐残留农药主要工程杂质来源及检查意义水分——结块、霉变或有效成分水解灰分——控制药物本身及泥土、沙石等无机杂质砷盐——剧毒，常由除草剂、杀虫剂或化肥引入重金属——环境污染和使用农药引入残留农药——有毒烘干法〔不含或少含挥发性成分〕甲苯法〔含挥发性成分〕减压枯燥法〔含挥发性成分贵重药〕GC法1、水分测定法酸不溶性灰分的测定△△总灰分的测定2、总灰分和酸不溶性灰分的测定WHO规定植物药铅≤10ppm镉≤0.3ppm干法破坏湿法破坏硫代乙酰胺法3、重金属的测定干法破坏〔ChP〕湿法破坏〔USP〕△△(调到中性)△碱融法破坏湿法破坏碱融法H+4、砷盐的测定5、残留农药的测定1、总氯量的测定2、总磷量的测定3、GC法中国药典中药制剂含量测定所占比例版本%19771.4819855.3119908.73199512.81200062.09〔HPLC36%TLCS24%GC3%)含量测定（五）测定工程的选定原那么1首选君药及贵重药、剧毒药建立含量测定方法2其次考虑臣药及其他味药3有效成清楚确的，可选有效成分4成分类别清楚的，可测某一类总成分的含量5检测成分应归属某单一药味6检测成分应与中医用药的功能主治相近7确无法含量测定的，可测定浸出物含量化学分析法色谱法常用定量方法分光光度法1、化学分析法重量分析法容量分析法特点A、准确度、精密度高B、抗干扰能力差例2、分光光度法UV法比色法特点A、灵敏度高B、简便、快速C、精密度稍低D、干扰多芦丁黄芩苷小檗碱丹皮酚3、TLCS法测定薄层板上斑点对单色光的吸收或反射的强度而进行定量的方法特点A、别离效果好B、适用于无法用UV、HPLC法测定的组分C、准确度、精密度低于HPLC2000年版中国药典〔2000年版〕

薄层扫描法品种品种数量TLCS数量占总数%534〔药材〕203.74458〔成药〕326.99978〔总数〕5210.73（1）、选择测定条件1〕薄层色谱条件别离好不拖尾2〕检测方法吸收测定法荧光测定法反射法透射法3〕扫描方式单波长双波长线性扫描法锯齿扫描法外标法内标法4〕散射参数SX薄层板的散射使Kubelka-Munk方程〔1〕薄层板均匀、平整（2）注意事项〔2〕点样量准确〔4〕显色剂均匀、适当〔5〕保护斑点用相同大小洁净玻璃盖住薄层板，并用透明胶纸封住边缘，以起固定和隔绝空气作用〔3〕斑点应完全别离，不拖尾

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样样对对样样对对样样对对

低高

低高

低高

外标法〔两点校正法〕4、HPLC法RP-HPLC色谱柱ODS流动相甲醇-水PIC反离子氢氧化四丁基铵色谱柱ODSRP-PIC反离子烷基磺酸盐无机阴离子外标法和内标法离子对色谱法〔PIC〕极性流动相中参加离子对试剂，与被分析离子生成中性离子对，从而增加在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增大2000年版中国药典〔2000年版〕

HPLC法品种品种数量HPLC数量占总数%534〔药材〕5410.11458〔成药〕4810.48978〔总数〕10220.59中药制剂分析的进展〔一〕新方法的研究进展1、计算药物分光光度法2、模式识别法〔二〕新技术的研究进展1、多维色谱及连用技术2、药理、生物测定技术〔三〕微量元素分析的研究进展应用实例-小青龙合剂[处方]麻黄125g桂枝125g白芍125g干姜125五味子125g细辛62g甘草(蜜炙)法半夏188gNOTES：合剂是在传统汤剂根底上改进后的一种新剂型生物碱桂皮醛芍药甙挥发油三萜皂甙应用实例-小青龙合剂[制法]以上八味，细辛、桂枝提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集，药渣与白芍、麻黄、五味子、甘草加水煎煮至味尽，合并煎液，滤过，滤液和蒸馏后的水溶液合并，浓缩至约1000ml。法半夏、甘姜照流浸膏剂项下渗漉法，用70%乙醇作溶剂，浸渍24小时后进行渗漉，漉液浓缩，与上述药液合并，静置，滤过，滤液浓缩至1000ml，参加苯甲酸钠3g与细辛、桂枝挥发油，搅匀，即得。[性状]本品为棕黑色的液体；气微香，味甜、微辛。[功能与主治]解表化饮，止咳平喘。用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。[用法与用量]口服，一次10-20ml，一日3次，用时摇匀。方药分析：君麻黄—发汗为君臣桂枝—解表为臣佐甘草—恐发汗太过,佐以甘草缓之使白芍、干姜、细辛、法半夏、五味子—几药合力共为使。可外发汗，内行水，散表里之邪。汉代张仲景《伤寒论》——小青龙汤近代由重庆桐君阁中药厂该汤剂为合剂本方治疗伤寒表不解，心下有水气，干呕，发热而咳。近代也用于慢性支气管炎，支气管哮喘、肺气肿，均见咳、喘、痰白清稀者。供试品溶液与阴性对照液的制备：取合剂10ml，石油醚分3次萃取，合并石油醚萃取液[油层]，浓缩至1ml，为供试品溶液A；[水层]用Na2CO3调PH11-12，用氯仿萃取，合并氯仿萃取液，回收氯仿至干，残渣用1ml甲醇溶解，为供试品溶液B；NOTES：阴性对照液如上法同步进行。1.桂皮醛的鉴别取供试品液A、阴性对照液、桂皮醛对照液〔1ug/ml〕15ul，点于同一硅胶G板上，环己烷-乙酸乙酯〔17：3〕展开，晾干，喷2，4—二硝基苯肼乙醇T.S，供试品A与对照品在相应位置上显相同的橙色斑点，而阴性对照液无此斑点。2.细辛挥发油的鉴别取供试品液A、阴性对照液、细辛挥发油对照液〔1：10乙醚液〕5ul，点于同一硅胶G板上，环己烷展开，晾干，喷10%香草醛浓硫酸T.S，加热至显色，供试品A与对照品在相应位置上显相同的粉红色斑点，而阴性对照液无此斑点。3.麻黄碱的鉴别取供试品液B，阴性对照液，麻黄碱对照品液〔1mg/ml〕各5ul，点于同一硅胶G，氯仿-甲醇-浓氨水〔20：5：0.5〕展开，晾干，喷茚三酮T.S，加热至斑点显色，供试品B与对照品在相应位置上显相同的蓝紫色斑点，而阴性对照液无此斑点。取合剂5ml，上聚酰胺柱，DW洗脱，洗脱液水浴浓缩至干，用1ml甲醇溶解，为供试品溶液C；聚酰胺柱再用95%乙醇洗脱，弃取洗脱液，用3M氨乙醇液洗脱，收集洗脱液水浴蒸干，1ml甲醇溶解，为供试品溶液D。4.芍药甙的鉴别取供试品液C、阴性对照液、芍药甙对照液〔1mg/ml〕10ul，点于同一硅胶G板上，氯仿-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-甲酸〔8：1：2：0.04〕展开，晾干，喷10%硫酸乙醇液，加热至显色，供试品C与对照品在相应位置上显相同的紫色斑点，而阴性对照液无此斑点。5.甘草酸的鉴别取供试品液D、阴性对照液、甘草酸铵对照液〔2mg/ml〕2ul，点于同一硅胶G板上，乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-蒸馏水〔30：2：2：4〕展开，晾干，喷10%硫酸乙醇液，加热至显色，UV灯365nm观察，供试品D与对照品在相应位置上显相同的紫色斑点，而阴性对照液无此斑点。含量测定HPLC法测定芍药甙的含量仪器与色谱条件BECKMAN332型高效液相色谱仪163型可变波长紫外检测仪，220nm427型记录及数据处理仪色谱柱为YWGC18流动相乙腈-水〔15：85〕标准曲线制备精密称取芍药甙5.08mg，溶于水至50ml量瓶中，定容，分别吸取0.50、1.00、1.50、2.00ml于10ml量瓶中定容。回收率测定精密吸取除去白芍制成的合剂〔即阴性对照液〕0.3ml与适量芍药甙对照品液，通过0.5g聚酰胺柱，用水洗脱至50ml量瓶中至刻度，依前述条件测定，平均回收率为99.42%，RSD为0.23%〔n=3〕。样品测定取自制小青龙合剂摇匀，用滤纸过滤，精密吸取0.3ml滤液通过聚酰胺柱，以不同回收率测定条件进行测定。分析实例—万氏牛黄清心丸[处方]牛黄10g朱砂60g黄连200g黄芩120g栀子120g郁金80g分析实例—万氏牛黄清心丸[制法]以上六味，除牛黄外，朱砂水飞或粉碎成极细粉；其余黄连等四味粉碎成细粉；将牛黄研细，与上述粉末配研，过筛，混匀。每100g粉末加炼蜜100-200g制成大蜜丸，即得。古方为糊丸，亦有水丸[性状]本品为红棕色至棕褐色的大蜜丸；气特异，味甜、微涩、苦。[功能主治]清热解毒，镇惊安神。用于热邪内闭，烦躁不安，神昏谵语，小儿高热惊厥。[方药分析]本方来源于明.«痘疹世医》心法，本方为清心开窍剂，主治热邪内陷心包所致窍闭神昏症。方中牛黄，清心解毒，豁痰开窍为君药；黄连、黄芩、栀子清热泻火，为臣药；朱砂清心，重镇安神，郁金行气开窍共为佐使药，合用以奏透邪泻热，开窍安神之效。[方药分析]牛黄—清热解毒药，主含胆酸类成分。黄连—清热燥湿药，主要为小檗碱。黄芩—清热燥湿药，主要为黄酮类。栀子—清热泻火药，主含栀子甙。朱砂—安神药，主含硫化汞〔HgS〕。郁金—活血去瘀药，主含挥发油。鉴别显微鉴别郁金—糊化淀粉团块几乎无色。栀子—种皮石细胞。黄芩—纤维淡黄色，梭形，厚壁，孔沟细。黄连—纤维鲜黄色，壁稍厚，纹孔明显。朱砂—不规那么块状物或颗粒状物，暗红棕色、鲜红色或棕黄色。郁金—糊化淀粉团块栀子—种皮石细胞黄芩—纤维黄连—纤维朱砂—不规那么块状物或颗粒状物，暗红棕色、鲜红色或棕黄色化学鉴别1.朱砂的鉴别取本品3g，加水适量，研匀，反复洗去悬浮物，可得少量朱红色沉淀，取出，参加盐酸1ml及铜片少量，加热煮沸，铜片由黄色变为银白色。HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg+H2SNOTES：在酸性条件下，朱砂与铜片发生置换反响析出金属汞，在铜片外表形成银白色汞齐。2.人工牛黄的鉴别取本品，剪碎，加硅藻土0.6g，研匀，加氯仿10ml、冰醋酸0.5ml，加热回流30min,放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。胆酸和猪去氧胆酸加乙醇制成1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。TLC法CMC-Na，硅胶G展开剂醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇〔32:6:1:1〕显色剂10%磷钼酸乙醇液，1100C,10min人工牛黄供试品牛黄空白猪去氧胆酸胆酸3.黄芩的鉴别供试品溶液的制备：取本品3g，剪碎，加硅藻土0.5g，研匀，加甲醇20ml，加热回流1hr,放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：黄芩甙对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。TLC法CMC-Na，硅胶G〔4%醋酸钠〕展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水〔5:3:1:1〕显色剂2%三氯化铁乙醇液使斑点更为集中-OH与Fe+3络合黄芩甙供试品黄芩空白4.栀子的鉴别供试品溶液的制备：取本品3g，加乙醚15ml，研磨，弃去乙醚。残渣挥干乙醚，加醋酸乙酯30ml，加热回流1hr,放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3ml溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：栀子甙对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。TLC法CMC-Na，硅胶G展开剂醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水〔10:7:2:0.5〕显色剂10%硫酸乙醇1050C,10min栀子甙供试品栀子空白5.黄连的鉴别供试品溶液的制备：取含量测定项下剩余的盐酸-甲醇提取液4ml，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，使成1ml作为供试品溶液。对照药材溶液的制备：黄连对照药材50mg，加甲醇10ml，回流加热15min,滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。对照品溶液的制备：再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。TLC法硅胶GCMC-Na展开剂苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液〔12:6:3:3:1〕显色剂UV〔365nm〕盐酸小檗碱黄连公式品供试品黄连空白含量测定1.朱砂取本品约5g，剪碎，精密称定，置250ml凯氏烧瓶中，加硫酸30ml与硝酸钾8g，加热俟溶液至近无色，放冷，转入250ml锥形瓶中，用水50ml分次洗涤烧瓶，洗液并人溶液中，滴加1%高锰酸钾溶液至显粉红色，两分钟内不消失，再滴加2%硫酸亚铁溶液至红色消失后，加硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液滴定，即得。每1ml的硫氰酸铵滴定液相当于11.63mg的硫化汞。硫酸与硝酸钾—分解试样及有机破坏高锰酸钾溶液—除去试样分解时产生的亚硫酸粉红色两分钟内不消失—亚硫酸可将Hg2+复原Hg+使含量变低，观察两分钟完全除去亚硫酸硫酸亚铁溶液—除去过量的高锰酸钾滴定反响Hg2++2CNS-→Hg(CNS)2显色反响CNS-(过量)+Fe3+→Fe(CNS)2+(红色)2.黄连取本品约4g，剪碎，精密称定，置索氏提取器，盐酸-甲醇〔1:100〕适量，加热回流提取至提取液无色，提取液移至50ml量瓶中，用盐酸-甲醇适量稀释至刻度，摇匀，照柱色谱法，精密量取5ml，上AL2O3柱,25ml洗脱，收集洗液置50ml量瓶中，乙醇稀释至刻度，精密吸取2ml置50ml量瓶中，加0.05mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。UV345nm测定A。为728,本品含总生物碱按盐酸小檗碱计不得少于1.7%。黄连方中臣药之首用量最大有效成分清楚黄连有效成分为小檗碱，尚含其它少量生物碱，如黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、巴马亭等，均为原小檗碱型生物碱。硫酸溶液—在酸性条件下，N原子呈共轭体系的季铵状态，在345nm处有最大吸收。其它五味药的空白提取液在该波长处略有吸收，约相当于0.3%小檗碱，因此测定结果偏高。本品为蜜丸制剂，其黄连生物碱溶出速率较药材相对缓慢，回流至提取液无色后应放置一段时间。第二节生化药物分析简介一、定义生化药物指运用生物化学的理论、方法和技术，从动物、植物及微生物等生物体中提取别离的天然活性物质，以及这些物质及其衍生物的化学合成、半合成和现代生物技术制得的产品。一、生化药物分析的特点〔一〕分子量的不确定性生化药物除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激素等属化学结构明确的小分子化合物外，大局部为大分子的物质〔如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等〕，其分子量一般几千至几十万。对大分子的生化药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。甚至化学结构也不确定，因此要进行纯度测定及分子量测定。〔二〕分析工程的特殊性1、分析方法：生物检定法检定活性2、平安性检查：热源检查、异常毒性试验等3、效价测定：酶类药物〔三〕分析方法多样性理化测定法、生化测定法、生物检定法二、生化药物的分析方法〔一〕鉴别１、化学反响法利用药物与某试剂在一定条件下反响，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法：溶菌酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子〔Cu2＋〕络合，生成有颜色的络合物，肽键越多，产生的颜色越深。胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法：胃蛋白酶是具有高效、专一催化活性的特殊蛋白质，易受酸、碱、重金属或有机溶剂等的作用，破坏蛋白质肽链的空间结构，引起蛋白质变性，生成不溶性的沉淀。２、紫外分光光度法三磷酸腺苷二钠的分子中具有共轭系统，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L盐酸水溶液〔20μg／ml〕，在〔257±1〕nm的波长处有最大吸收。A250nm／A260nm的值应为0.17～0.27。３、酶法尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原，而具有相同作用的链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标。4、电泳法例：肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相应，5、生物法利用生物体进行试验来鉴别药物

〔二〕杂质检查生化药物分子较大，结构复杂，有时成分并非单一，纯化工艺较难，因此，生化药物的杂质检查就显得非常重要。1、一般杂质检查生化药物的一般杂质检查工程包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及枯燥失重、炽灼残渣等。其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同，2、特殊杂质检查特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。例如，胰蛋白酶是从动物膜中提取制得的一种蛋白水解酶，在制备过程中．易带入杂质糜蛋白酶，中国药典〔1995年版〕和USP〔23〕均规定要检查此酶，根据胰蛋白酶的特性选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯为底物作糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为2500个胰蛋白酶单位中不得大于50单位，按每1mg胰蛋白酶为2500个单位和每1mg糜蛋白酶为1000单位，折算成重量，那么糜蛋白酶的限度为5％〔g／g〕。〔三〕平安性检查1、热源检查：内毒素，家兔法〔家兔法〕本法是将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，以其体温升高的程度，判定该供试品中所含热原是否符合规定，是一种限度试验法。2、异常毒性试验：急性毒性反响的限度试验是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反响。反响的判断以试验动物死亡与否为终点。中国药典规定的异常毒性试验，实际上是一个限度试验。在此剂量条件下，一般供试品不应使试验动物中毒致死；如果出现试验动物急性中毒而死亡，那么反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平，因此，本试验又称异常毒性检查法。异常毒性试验的动物为小白鼠。试验操作方法有尾静脉注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服给药法等。检查生产过程是否引入引发异常毒性的杂质3、过敏试验：检查异性蛋白药物中假设夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人多种过敏反响，轻者皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒息、发结、血管神经性水肿、血压下降，甚至休克和死亡。因此，有可能存在异性蛋白的药物、应作过敏试验。例如，细胞色素C是蛋白制剂，在制备中可能掺入少量杂蛋白，为保证使用平安，中国药典规定细胞色素C溶液及细胞色素C注射液应做过敏试验。4、降压物质检查：降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织内存在的组胺及局部氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质，均为这类杂质的来源。采用猫〔狗〕血压法5、无菌检查是检查药品及敷料是否染有活菌的一种方法，是药典中较重要的检查工程之一。根本步骤：①培养基的制备，②选择对照用菌液，供对照试验用。③具体检查，如接种、培养等操作。④结果判断，得出阴性或阳性的结论。〔四〕含量〔效价〕测定生化药物的含量表示方法通常有两种：一种用百分含量表示，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。另一种用生物效价或酶活力单位表示，适用于酶类、蛋白质类等药物1、酶法：酶活力测定法酶分析法〔1〕酶活力测定法所谓酶活力，是指酶催化一定化学反响的能力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反响的速度。酶反响的速度可以用单位时间反响底物的减少或产物的增加来表示，酶反响的速度愈快所表示的酶活力愈高。测定酶活力，可用物理法，化学法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一：终点法：在适当的条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间。第二：将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反响的连续变化，如吸收度的增加或减少。第三：将酶与底物混合后，让其反响一定时间，然后停止反响，定量测定底物减少或产物生成的量。后两种方法称为动力学法或反响速率法：按取样及检测的方式可称为取样测定法或连续测定法。酶促反响的条件1〕底物：一般选用底物的浓度［S］＝lookm，因为在这种情况下反响速度可达最大速度的99％。大多数酶具有相对的专一性，在可被它作用的各种底物中一般选择Km小的作测定的底物。2〕pH：氢离子浓度能对酶反响产生多种影响：它可能改变酶的活性中心的解离状况，升高或降低酶的活性；也可能破坏酶的结构与构象导致酶失效；还可能作用反响系统的其它组成成分影响酶反响，甚至改变可逆反响进行的方向。选择适宜的反响pH，并将反响维持在这一pH值，酶反响通常借助缓冲系统来控制pH。3〕温度：酶反响对温度十分敏感，因为温度能直接影响化学反响速度本身，也能影响酶的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催化机制。一般而言，温度变化1℃，酶反响速度可能相差5％左右。因此，实验中温度变动应控制在土0．1℃以内。酶反响的温度通常选用25℃、30℃或37℃。4〕辅助因子：有些酶需要金属离子，有些酶那么需要相应的辅酶物质5〕空白和对照：每个酶反响通常都应该有适当的空白和对照。空白是指杂质反响和自发反响引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可通过不加酶，或不加底物，或二者都加〔但酶需预先经过失效处理〕。对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。测定方法1〕、终点法：2〕、取样测定法：在酶反响开始后不同的时间，从反响系统中取出一定量的反响液，并用适当的方法停止其反响后，再根据产物和底物在化学性质上的差异，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反响变化量的方法。停止酶反响通常采用添加酶的变性剂的方法，如加5％的三氯醋酸、3％的高氯酸或其它酸、碱、醇类。常用的检测方法有可见．紫外分光光度法、荧光分析法等。3〕、连续测定法连续测定法那么是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反响过程中对反响系统进行直接连续检测的方法。，显然从准确性和测定效率看连续法都比较好。a〕紫外-可见分光光度法：这是根据产物和底物在某一波长或波段上，有明显的特征吸收差异而建立起来的连续检测方法。b〕荧光分析法：它的原理是，如果酶反响的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变化的速度可代表酶反响速度。c〕旋光度法：某些酶反响过程常伴随着旋光变化，在没有其它更好的方法可用时，可考虑用旋光度测定法。d〕酶偶联测定法：所谓酶偶联法是应用过量、高度专一的“偶联工具酶〞，使被测酶反响能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。以和光学检测法相偶联的分析法为例：e〕其他：其他检测法有电化学测定法；离子选择性电极测定法适用于产酸反响中pH变化的测定；放射化学法的特点是灵敏度极高，可直接用于酶活性测定，缺点是操作繁而费时。〔2〕酶分析法酶分析法是一种以酶为分析工具〔或试剂〕的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂1)．动力学分析法:这种分析法的原理是：通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反响中起决定反响速度的主导作用，这时酶反响速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反响的速度就可求出它们的浓度2)．总变量分析法:又称为平衡法或终点法。根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，然后在反响完成后，借助物理化学方法测出其总变化量，并参考反响的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。仅适用于底物物质的测定，应用时应考虑工具酶的用量与反响的平衡点。2、电泳法电泳法具有灵敏度高、重现性好、检测范围广、操作简便并兼备别离、鉴定、分析等优点，故已成为生物技术及生化药物分析的重要手段之一。(1〕电泳法的根本原理和分类原理：在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。电泳别离是基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的。l〕自由界面电泳：在二根U形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况根本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。2〕区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。根据所用的支持物不同可分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和十二烷基硫酸纳〔SDS〕聚丙烯酰胺凝胶电泳法。3〕高效毛细管电泳：是在一根内径约50μm的毛细管中，在高压电场下进行样品别离分析的一种新型电泳技术。〔2〕常用电泳法的类型及其应用1〕．纸电泳法：是用滤纸作为支持介质的一种电泳法，其操作要点如下A〕缓冲液的选择：应根据供试品的理化特性，需要的电泳速度和分辨力，选择适宜的缓冲液、pH值和离子强度。B〕滤纸的裁剪：滤纸可按需要裁成与电泳槽相当的长方形或长条形，样点的间距为2～3cm，滤纸长度视电源输出最高