布鲁克液质联用操作规程

布鲁克液质联用仪操作规程1操作前检查1.1检查液氮罐和高纯氮的出口压力，保证在正常范围1.2检查洗针溶液和流动相1.3流动相须现配并超声，缓冲盐溶液过0.22μm微孔滤膜〔或者使用色谱纯的盐溶液和酸溶液〕1.4如使用溶融石英进样管，操作前应检查石英管是否拉长，确保其未超出ESI探针尖端。1.5检查系统真空度，电离真空计读数〔分析仪区域〕应小于5×10-6Torr。1.6检查废液液位，及时清空废液。1.7检查液氮罐和氦气钢瓶是否有一定压力，以便为测试样品提供符合流速和压力要求的氮气〔喷雾气体和枯燥气体〕和氦气〔碰撞气体〕。2操作步骤及考前须知1．检查并翻开枯燥气(Drygas)和雾化气(NebulizerGas)所需的氮气源；1)如配备液氮罐，那么需翻开增压阀及供气阀阀门，使罐体压力保持在100psi以上，并调节减压阀出气口压力至0.6Mpa；2)如配备氮气发生器，那么提前半小时翻开氮气发生器电源，以便使氮气能够到达99.99%以上的纯度，再调节氮气流量至20L/min；2．检查并翻开碰撞气(CollisionGas)高纯氮气N2或高纯氩气Ar钢瓶〔纯度要求99.999%〕，并调节减压阀出气口压力至0.4Mpa；3．检查机械泵泵油的水平线，需在小窗口的1/2～2/3之间；4．翻开计算机，显示器电源；5．翻开质谱仪主机电源〔仪器左侧最下方〕；6．启动micrOTOFcontrol控制软件，务必保持仪器一直处在shutdown状态，待真空度到达≤1×10e-6mbar后，才可切换至standby状态待机；为了保证良好稳定的实验结果，待真空度下降至10e-7mbar以下后，再operate仪器开始测试。2.2新建液相方法翻开hystar软件，选择method，然后输入新建方法的名字，点击open，开始方法的新建。在弹出的对话框中选择edit，然后点击“wizard〞进行设置。液相方法包括梯度、流速、柱温、样品盘温度、时间、进样针吸样速度等，可依次设置即可，全部设置好之后，将。2.3新建质谱方法方法一：在otofcontrol中，翻开method，按照自己待检测物的分子量范围及正负偏向性选择适宜的质谱方法，小分子有对应的smallmolecular方法，蛋白质组有专门的proteomics方法。方法二〔非专业人员不推荐〕：在otofcontrol中，翻开method，选择new，即可新建质谱方法。可以修改的参数包括以下几个方面：〔1〕mode中的Focus为active，linespectracalculation为usesumintensity，ionpolarity为pos或neg，massrange调到待检测物适宜的分子量范围。〔2〕source中capillarypos：4500V，neg：3500。Divertvalve：source1-2进质谱；source1-6为discardtofluid〔3〕Tune中collisionRF小分子调到1000-1500，大分子调到2000-2500；lowmass视目标物分子量大小截留〔例如目标分子为500，可调为300，去掉小分子区域的杂峰〕。〔4〕MS/MS中如果想检测二级，可以勾选autoMS/MS；precursorions中cycletime正常下为3s〔5〕chromatogram中选择BPC根据待检测物的分子量大小和正负偏向性，先在软件自带的质谱方法中选择相应的方法，再在此方法的根底上进行优化及分段〔如含盐的样品截掉前2-5分钟，1-6waste〕。仪器在操作状态下<Operation>稳定20-30分钟后即可开始仪器质量准确度校正。2.4仪器质量准确度校正2.2.1.药物和酶解多肽样品，选用甲酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z90-1200；校正模式选用<EnhancedQuadratic>。2.2.2.蛋白质类样品选用三氟乙酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z200-2000；校正模式选用<Quadratic>。2.2.3.校正液配制甲酸钠校正液：溶剂：异丙醇:水溶液=1:1并含有0.2%甲酸10mM甲酸钠校正液：1ml1MNaOH+99ml溶剂三氟乙酸钠校正液：溶剂：50%乙氰含有0.1%三氟乙酸钠(TFA)2.2.3.<Calibration>校正界面3.测样方式3.1直接进样测定对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品，如果仅需要进行鉴定，可以采用直接进样方法测定。3.1.1样品用标准溶剂〔50%H2O，50%乙腈或甲醇，0.1%甲酸〕溶解或稀释3.1.2将配好的样品或标准品吸入进样器〔针〕，将进样器〔针〕放置于进样泵中。注意：进样器〔针〕内不能有气泡3.1.3将进样器〔针〕直接与离子源连接〔如图〕注意毛细管与注射器之间需紧密连接。进样器内不能有气泡3.1.4设置进样泵的流速为120～180微升/小时。3.2液质联用〔LC/MS〕测定样品采用常规液相色谱系统〔色谱柱2.1x150mm；流速200-300uL/min〕。启动Hystar软件，翻开hystar软件，在sampletable中选择相应的文件并翻开，然后复制一个之前做过的样品，对复制后的新的一行进行文件名，存储路径和液相质谱方法的修改〔改完之后再检查一遍〕。注：如果是新建sampletable，可以翻开一个新的复制一行粘贴到新建里，因为新建的自动进样的不对。4.输入以下参考参数4.1.直接进样：〔低流速〕大约在120－180微升/小时离子源：Nebulizer0.4barDryGas4.0L/minDryTemp180℃4.2.药物小分子样品液质联用：平均流速大约在200-300uL/min离子源：Nebulizer0.8barDryGas6-8L/minDryTemp180℃4.3.酶解多肽样品液质联用：平均流速大约在200-300nL/min离子源：DryGas3.0L/minDryTemp160℃5.手动获得一个MS/MS图谱翻开MS/MS界面，选择MRM->输入<ParentCondition>列表，激活ScanMode。6.后期处理6.1翻开分析文件6.1.1.在任务栏中或者在工具栏中选择按钮均可切换到数据分析程序(DataAnalysis)，读取所获得的数据文件6.1.2.读取数据文件被可选择File菜单下的open对话框，所需要的显示窗口将被程序自动翻开。6.1.3.在文件对话框中选择目录d:\data\start用鼠标键双击test0000.d，test0001.d，test0002.d来翻开数据文件；按住shift键来标记所有文件并点击回车键来一次全部翻开所选文件。6.1.4.质谱图与色谱图按文件名读取并显示在File菜单下。在分析清单窗口下选择所需的文件，选择后图谱在各自的窗口下显示。6.2质谱图6.2.1.在分析清单窗口下选择的结果在质谱图窗口显示。6.2.2.通过Masslist参数对话框改变离子检测参数6.2.3.以下对话框被用来在图谱中设置新的离子检测参数6.2.4.对下一步的Method参数设置参见BrukeDaltonicsDataAnalysisReferenceManual6.3色谱数据6.3.1.完整色谱图1.读取数据文件〔e.g.test0001.d〕，显示TIC〔TotalIonChromatogram〕2.读取某一个离子的色谱数据可以翻开EditChromatogramTraces对话框3.通过Edit菜单下选择Chromatogram选项来翻开Traces对话框如以下图所示，选择质荷比为622的离子。6.3.2.获得各组分的质谱图〔Compoundspectra〕使用Find–>Compound功能键，快速有效的产生各组分的质谱图；1〕功能键<Compounds-Chromatogram>产生色谱别离过程中所有组分的质谱图。翻开CompoundSpectra窗口时，可以看到各组分的质谱图。2〕功能键<Compounds-MS(n)>产生所有采用MS(n)步骤采集的图谱。3〕<Compounds-AutoMS(n)>产生MS-和MS/MS图7.报告有几种可用的报告形式来输出数据，一种报告仅有质谱图，另一种报告那么只有色谱图，还有一种两种图谱都保存。7.1.直接打印：打印键；或者翻开File菜单，选择Print；或者通过打印预览打印，选择打印预览键或在File菜单项选择择PrintPreview，然后在打印预览窗口下选择打印键7.1.1报告内容下拉菜单包含了所有可选的报告内容7.1.2.获得参数报告选择此内容的报告中包含了获得所选分析结果的参数7.1.3.显示报告选择此内容将完全按照显示窗口打印〔包括色谱窗口、质谱显示窗口、混合物质谱窗口、质谱窗口〕7.2质谱图报告内容中几种可选的质谱图形式7.2.1.质谱清单报告报告中含所选的质谱图的peak清单7.2.2.质谱图报告报告中含所选的质谱图报告7.3色谱图报告内容中几种可选的色谱图形式7.3.1色谱清单报告报告中含所选的色谱图的色谱峰清单7.3.2色谱图报告报告中含所选质