第三章二级菌种和三级菌种的制备2013.03.28

食用菌生产多采用三级菌种繁育体系，也有采用二级菌种繁育体系的。经过扩大培养，增加菌丝体的适应能力，使其粗壮;并检验菌种生活力、纯度;扩大菌种数量，满足生产需要。第三章二级菌种和三级菌种的制备第一节培养料的配制与灭菌第二节接种与培养第三节质量鉴定第四节液体菌种生产和使用第一节培养料的配制与灭菌一、培养料的配制二、培养料的灭菌一、培养基的配制㈠培养料配制的原则㈡培养料常用配方㈢培养料配制工艺流程㈠培养料配制的原则●要选择适宜的营养物质●营养物质配制的比例要适当●选择经济使用来源广泛的原料●适宜的酸碱度㈡培养料常用配方

常用的配方为78：20：1：1

78：指供应碳源的主料，包括木屑、玉米芯、秸秆、稻草等。

20：指米糠、麸皮。

1：指糖。

1：石灰、石膏等㈡培养料常用配方木屑培养基棉籽壳、蔗糖培养基玉米芯、花生壳培养基

木屑培养基

﹡阔叶树木屑78%，米糠或麸皮20%，蔗糖1%，石膏粉1%。木屑培养基

﹡阔叶树木屑93%，米糠或麸皮5%，蔗糖1%，尿素0.4%，碳酸钙0.4%，磷酸二氢钾0.2%。木屑培养基

﹡阔叶树木屑75%，麸皮22%，蔗糖1.5%，石膏粉1.4%，维生素B10.1%。

适用于平菇、凤尾菇、木耳、猴头、灵芝、金针菇、榆黄蘑等菌种的培养。

棉籽壳、蔗糖培养基

﹡棉籽壳78%，麸皮20%，蔗糖1%，石膏粉1%。棉籽壳、蔗糖培养基

﹡棉籽壳96%，蔗糖2%，过磷酸钙1%，石膏粉1%。

适用于平菇、凤尾菇、毛木耳、金针菇等菌种的培养。玉米芯、花生壳培养基

﹡玉米芯%，米糠或麸皮20%，蔗糖1%，石膏粉1%。玉米芯、花生壳培养基

﹡玉米芯80%，米糠10%，玉米粉8%，石膏粉1%，磷酸二氢钾0.2%。

玉米芯、花生壳培养基

﹡花生壳78%，米糠20%，蔗糖1.5%，石膏粉1%。

适用于平菇、香菇、木耳、猴头、灵芝等菌种的培养。㈢培养料配制工艺流程●称料●拌料●调节pH●分装培养料●分装容器的封口●称料

将预处理过的培养料（以不刺破容器为准，过4目的筛子），按生产规模进行称取。先称主料，后称辅料。●拌料

将不溶性的料干混均匀，可溶性的料加少量的水配成母液，边泼浇边混拌，含水量为60%。●调节pH

将培养料堆闷0.5～1.0h后，测定酸碱度，因为灭菌后pH下降1～1.5，所以高调1～1.5，调致6.5～7.0较为合适。●分装培养料

分装培养料时，边装边压，松紧适中（中下部稍松，上部稍紧），然后平整料面，在料中央打洞。﹡料中央打洞的目的

1.增加培养料与空气的接触面积以利菌丝生长；

2.便于固定接种块；

3.让部分菌种掉进洞内，增加接种点，缩短发菌周期。●分装容器的封口

﹡瓶装容器的封口：罐头瓶用12㎝×12㎝×0.004㎝的低压聚乙烯或聚炳烯膜封口；

﹡袋装容器的封口：用无棉盖体封口、拧口、折口等。二、培养料的灭菌●常压蒸气灭菌●高压蒸气灭菌●灭菌效果的检验●常压蒸气灭菌

当低层培养料的温度达到100℃时，保持8～12h，培养料内的杂菌已被彻底杀死。●高压蒸气灭菌

在121～128℃、0.11～0.14MPa下，木屑、棉耔壳培养料保持1～1.5h，谷粒培养料则需2.0～2.5h。●灭菌效果的检验

随机抽样，置于25～30℃的条件下，培养3～5d，若没有杂菌长出，说明灭菌彻底。

第二节接种与培养一、接种设备的使用规程二、二级菌种和三级菌种的接种三、二级菌种和三级菌种的培养

一、接种设备的使用规程●接种室使用规程●超净工作台使用规程●接种箱（室）的杂菌检查●接种室使用规程

1.使用前半小时，把所需物品搬入接种场所喷雾消毒，关闭门窗，开启紫外线灯照射0.5h。

2.穿上工作服和鞋，戴好口罩、帽，用2％来苏尔洗手。

3.操作前，用酒精棉球擦手。操作时，减少空气波动。两人操作时应配合默契，用完的废棉球等应丢到废物桶内。

4.接种结束及时收拾台面，然后用石炭酸喷洒。

5.注意安全。如棉塞着火，用手紧握或用湿布扑灭，勿吹。若有带菌物洒落，用抹布沾石炭酸，收拾到废物桶内，用酒精棉球擦手后再继续操作。●超净工作台使用规程1.把超净工作台用75％酒精擦净。2.搬入培养料和菌种。3.接种工具事先高温灭菌备用。双手用酒精棉球擦净。4.开动机器约20min后，接种区空气净化完成，即可接种。

5.操作时，动作轻盈，头、手尽量置于接种材料的下风侧，接种用具放在台面两侧。

6.接种结束，移去接种材料，再停止运转。7.如经常使用，每2～3个月检查一次空气的无菌程度。如不合标准，应及时更换超细纤维过滤板。●接种箱（室）的杂菌检查1.制备6支PDA或牛肉膏的斜面或平板。

2.斜面打开棉塞，直立放置0.5h。培养皿开盖5min，并在接种过程中和接种完毕时，进行同样检查。写明标签，检查熏蒸、喷雾消毒药液及紫外线灯光杀菌的效果。3.将检查的6支斜面或6个培养皿，置于30℃下培养48h，检查菌落生长数。

4.平板内≤3个菌落，斜面上无菌落的为合格。否则为污染严重。霉菌多时，用石炭酸喷雾后用甲醛熏蒸。如细菌多，可用乳酸和甲醛交替熏蒸。二、二级菌种和三级菌种的接种●接种的无菌操作规程●二级菌种的接种●三级菌种的接种●塑料袋接种●几种简易的接种方法●接种的无菌操作规程

1.按种空间彻底灭菌。凡是菌种所暴露的部位或通过的空间，都必须是无菌区。

2.酒精灯火焰封口(瓶口或管口)。3.接种工具灼烧后冷却，再取菌种，所取菌种不得在火焰旁停留，也不要通过火焰，以免菌种烧伤。4.封口物，不要随便放在台面上,管口或瓶口不得和其他物体接触。5.接种工具彻底灼烧灭菌（包括进入试管的其他部位）。

6.接种过程中，管口或瓶口，应立即烧灼，以烧死多数杂菌。在操作时，试管口或瓶口不得离开火焰附近，在无菌区即可。7.烧灼的接种工具冷却后，取少许菌种迅速抽出。注意不要碰到管、瓶壁，取出时不可通过火焰，以免烧死菌丝。8.

将取出的菌种迅速送入待接袋(或)内培养料的孔内。

9.抽出接种工具，将管口(或瓶口)在火焰上烧灼，立即封口。●二级菌种的接种

把试管菌种接入二级菌种培养料中的过程称为二级菌种接种。二级种要求纯度高、质量好。●二级菌种的接种

﹡接种前的准备

﹡二级菌种的接种﹡接种前的准备

1.一级种选择：选择种性纯正，健壮、浓密、整齐的一级种。2.接种箱(室)消毒：用84喷洒后再开紫外灯20min。用酒精棉球擦管（瓶）外面，管口、瓶口和棉塞都要在火焰上烘烤。一点接种

切取2㎝菌种，迅速送入菌种瓶内的接种穴上，立即封口。每支一级菌种可接5～8瓶二级种。

两点接种

先在接种穴内放一块菌种，后在接种穴口上放一块菌种。每支斜面菌种可接二级菌种3～5瓶。接种箱、超净台接种箱、超净台接种箱、超净台●三级菌种的接种

把二级菌种接入三级菌种培养料中的过程称为三级菌种接种。三级菌种用玻璃瓶或塑料袋生产。●三级菌种的接种﹡接种前的准备﹡三级菌种的接种﹡塑料袋接种﹡几种简易的接种方法﹡接种前的准备

把所需物品搬入接种箱(室)中，将二级种横置于接种架上，待接种的料瓶(袋)卧放。然后对接种场所进行消毒处理。﹡三级菌种的接种

用酒精棉球擦拭瓶外壁，以火焰瓶口。夹取燃着的酒精棉球，烧灼二级种瓶口、瓶颈内壁，进行瓶口消毒。用灼烧后的镊子扒去老菌皮，捣碎菌料，火焰封口，放在接种瓶架上。

单人操作时，左手执料瓶，右手拔去棉塞用小指和手掌夹住，掀起封口纸一个小角。右手执接种工具，灼烧后，取2㎝大小原种块。迅速投入料瓶内。一般每瓶二级种可接40～80瓶三级种。﹡三级菌种的接种﹡塑料袋接种

由于塑料袋质软，袋口不能直立，又不能接近火焰，操作不不埂。最好在无菌条件较好的接种箱(帐)内接种。接种时采用单人或双人操作法进行接种。﹡几种简易的接种方法1.蒸气接种法2.电炉接种法3.扇形多头酒精灯接种法

1.蒸气接种法⑴原理⑵方法⑴原理

需要小接种室和一套蒸气发生器。电炉上放一铝锅，作为蒸气发生器，在锅盖中央挖一个直径10厘米的圆孔，蒸气在圆孔内集中向外扩散，把含有杂菌的空气排开，形成无菌区。⑵方法

接种前，向空中喷水，使空中孢子随水滴沉降。将培养料趁热搬进接种室，待料温降至30℃以下时开始接种。在此之前将水烧开，把接种工具等放入水中煮沸15分钟、然后即可接种。

两人配合，一人左手握菌种瓶(或管)，右手拿接种工具，负责将菌种接入待接的瓶、袋内，另一人将待接的瓶、袋开塞或开口，接入菌种后立即封口。菌种瓶口、接种工具，待接瓶口(或袋口)及棉塞，不得离开蒸气，以免感染杂菌。瓶口要稍向下倾斜。两人接种，一次可接500～800瓶。2.电炉接种法

800～1000瓦电炉，用薄铁皮做一个内径30～50㎝，高40～60㎝的圆筒，罩在电炉外即成。这样热流集中于筒顶口形成一个无菌区，其范围和热力远远超过酒精灯火焰。一套设备可供3～4人同时操作。操作时，尽可能缩短时间，以避免烫死菌丝。三、二级菌种和三级菌种的培养

需放置在适宜的环境条件下进行培养。菌种的培养实质是对菌丝体的培养。三、二级菌种和三级菌种的培养●培养的重点工作●出现的异常现象●培养的重点工作

1.二级种、三级种接种后，及时移入彻底处理过的培养室内培养，温度调致23～25℃，空气相对湿度65～70％。2.培养2～3d后检查杂菌。发现有污染的立即取出。开始每天检查一次，当菌丝覆盖培养料，并吃料1～2㎝时，每周检查一次。

3.检查温度变化。当菌丝快满瓶（袋）时，将培养温度降低2～3℃，起到壮菌的作用。4.培养3～5d后检查成活率。发现菌种块没有萌发的，应剔出单独放，一周后仍未萌发，要及时进行补种。5.培养室要保持空气新鲜、清洁、遮光，湿度过大时，要进行通风。

6.杀菌、杀虫、防鼠工作，贯彻始终。

7.菌种(特别是二级菌种)培养好后，及时使用。二级菌种满瓶后7～10d，菌丝处于快速生长期，适应性较强。三级菌种培育好后，要置于低温、干燥、清洁的室内避光保存一个月。●菌种培养中出现的异常现象

培养二级种和三级种时，若能选择优良菌种、合理配方、优质原料、严格灭菌、遵循无菌操作规程和科学培育，可培养出优良的二级种和三级种。但因种种因素，会出现异常现象，如杂菌污染、菌丝不萌发、不生长或菌丝发生萎缩衰退等现象。●出现异常现象的处理◆杂菌污染◆断菌◆退菌◆菌丝徒长◆不吃料◆杂菌污染◆杂菌污染◆杂菌污染◆杂菌污染◆杂菌污染◆杂菌污染﹡杂菌污染的原因﹡防止杂菌污染措施﹡杂菌污染的原因

1.如果杂菌在培养料的上、中、下部位同时发生。是由于培养料灭菌不彻底造成的。2.如果杂菌开始发生在接种块上。是母种或原种已被污染，或者是由于接种工具灭菌不彻底造成。3.如果杂菌先在培养基表面发生。由于接种过程中无菌操作不严格引起的。

4.如果杂菌在接种若干天后才发生，并首先发生在从瓶口往下生长的菌丝上，说明是从棉塞侵入培养料的。是培养室湿度过大，棉塞受潮，造成霉菌滋生所致。﹡防止杂菌污染措施

1.搞好环境卫生。制种人员必须建立起正常的清洁卫生制度，不断清除污物，并加以药剂消毒，不让杂菌有滋生的余地。2.处理好原料。严加管理，杜绝任其堆放原料，不加保护，上下受潮霉变、中间生虫、肮脏不堪的现象。

3.调整含水量和酸碱度。培养料的水分适当，酸碱度适宜，则发菌顺利，不易生杂菌。常见的毛病是；用水不称也不量，酸碱度不测更无调节。4.保护培养料。灭过菌的培养料应该加以保护。以为灭过菌，马虎了事，不遮不盖，污染严重。

5.严格遵守无菌操作规程。要耐心、细致，切忌碰擦粘带。

问题：器械不洗依靠熏，不擦酒精依靠熏，擦了酒精就不用火焰烧，碰擦污物不重烧等。正确作法

接种的用具、容器，能洗的要洗干净，能熏的要熏蒸，能擦酒精的要擦酒精，能用酒精灯火焰烧的要用火焰烧。大量的三级种可两人接种，把好火焰封锁关，一人持料瓶，一人接种，不离火焰无菌区，配合默契，动作敏捷。◆不吃料现象

接入菌种瓶内的母种或原种，菌丝不萌发；有些菌种块上的菌丝虽萌发，但不向料内生长，以后逐渐萎缩变黄。产生原因

1.培养料配方不合理，配制不科学。

2.培养料含水量、pH不适合，菌丝不吃料。

3.接种场所处理时，用药量过多或温度过高，致使菌丝受药害死亡。

4.灭菌以后，抢温接种温度过高，致使菌丝遇高温而死亡。

5.接种工具未冷却或菌丝块靠火焰太近，菌丝被烫死或烧死。

6.接入的母种或原种，在不条件下长期储藏，菌丝老化失去生长能力。

7.菌种瓶（袋）内潜入螨类，咬食菌种块，致使菌丝消失。

第四节液体菌种生产和使用液体菌种：在无菌条件下，将母种接种于合适的液体培养基中，给予适宜的条件，通过震荡、搅拌等方式培养出来的菌丝球称为液体菌种。第四节液体菌种生产和使用一、液体菌种的优点二、液体菌种培养液配方三、液体菌种的培养四、液体菌种的使用一、液体菌种的优点●菌种生产周期短●接于固体料中发菌快●菌龄整齐一致●接种方便二、液体菌种培养液配方

1.葡萄糖30％，豆饼粉2％，玉米粉1％，酵母粉0.5％，磷酸二氢钾0.1％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.05％，pH自然。适于多种食用菌的液体培养。

2.可溶性淀粉3～6％、蔗糖1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，酵母膏0.1％，pH值调至6。适于平菇、香菇、猴头菇，以平菇最为适宜。可溶性淀盼可增加培养液粘度，菌丝球小而多，菌丝球分散性好。

3.马铃薯20％，葡萄糖2％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B110毫克/升，琼脂0.05％，pH自然。适于培养香菇，菌丝生长快、菌球大、多，周围有绒毛，绒毛状菌普遍存在培养液中，有利于播种。

4.玉米粉4％，水解鱼粉2％，酵母膏0.1％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.05％，pH自然。适于培养金针菇，猴头菌。

5.葡萄糖2.5％，酵母膏0.35％，玉米浆(含氮量7.1％)0.18％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.006％，每升培养液内另加硫酸锌4毫克，硫酸锰5毫克，柠檬酸铁5毫克，维生素B10.1毫克。适于培养茯苓。三、液体菌种的培养

液体菌种的培养：采用摇床生产的摇瓶培养法和采用发酵罐生产的深层培养法。●液体菌种的摇瓶培养

摇床室温在24～26℃，培养72～96h。培养结束时，因菌种不同，培养液出现不同色泽。平菇，金针菇的培养液呈浅黄色，香菇、猴头菌的培养液呈黄棕色，清澈透明，有许多菌丝小球，并有菇香。木耳的培养液呈褐色、粘稠，有香甜味。培养液混浊，多是细菌污染。培养液经显微镜检查后。方可用于生产。

摇床培养，只适于固体菌种的接种。液体菌种供发酵罐接种，或接种于三角瓶内，每瓶接种10mL，继续摇瓶培养。因菌球正处于旺盛生长状态，分散性好，能缩短培养时间，快者2d即可终止培养。摇瓶培养的液体菌种，在4℃冰箱中保存1—2个月，在15～20℃室温中保存7～10天，对接种成功率，产量均无不良影响。摇瓶培养的液体菌种●液体菌种的深层发酵培养