DNA克隆技术课件

DNA克隆技术

目录DNA克隆技术一、概述（一）基本概念

1克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。2动物克隆3杂交DNA克隆技术克隆羊：个体水平细胞克隆：细胞水平DNA克隆：分子水平DNA克隆技术卵细胞C母绵羊子宫Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠DNA克隆技术4重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段DNA克隆技术DNA克隆技术5DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。DNA克隆技术生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）6基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。DNA克隆技术人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液DNA克隆技术DNA克隆技术（二）重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉DNA克隆技术1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子1997年,动物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程产品的出现

H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验2001年，人类基因组计划DNA克隆技术

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱目录DNA克隆技术（三）重组DNA技术技术路线目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

DNA克隆技术二、重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基DNA克隆技术（一）限制性核酸内切酶1核酸酶的分类2限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠDNA克隆技术第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。3命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶DNA克隆技术共性

（1）只作用于双链DNA

（2）活性有赖于Mg2+

（3）碱基识别特异性（4）切口形式6使用原则及注意事项

4分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）DNA克隆技术Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGDNA克隆技术BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口DNA克隆技术（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（三）T4噬菌体DNA聚合酶（四）TaqDNA聚合酶（五）反转录酶（六）连接酶（七）末端（脱氧核苷酸）转移酶（八）碱性磷酸酶DNA克隆技术

三目的基因及载体的分离（一）目的基因的获取直接从染色体DNA中分离

人工合成

1.60元/碱基基因文库反转录PCRmRNAcDNAPCR直接索取分分分DNA克隆技术

（二）基因载体定义能携带目的基因进入宿主细胞并且在宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分子。1载体的种类质粒DNA噬菌体DNA病毒DNADNA克隆技术（1）质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。DNA克隆技术λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）（2）噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列DNA克隆技术（3）病毒载体（4）粘性质粒DNA克隆技术2载体的条件有扩增所需的复制起始点，即能自主复制；有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；表达型载体必须具有指导基因表达的调控元件。DNA克隆技术多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体DNA克隆技术目录DNA克隆技术DNA克隆技术抗Amp宿主细菌含Amp培养基DNA克隆技术

标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H

片段COOH

片段DNA克隆技术X-galLacZ蓝色化合物X-galDNA克隆技术（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶DNA克隆技术克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。DNA克隆技术酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他载体DNA克隆技术四限制性内切酶剪切目的基因与载体切酶切DNA克隆技术BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录DNA克隆技术不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录DNA克隆技术磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶五、目的基因与载体的连接接DNA克隆技术

T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）

≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；DNA克隆技术

连接方式

相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接

DNA克隆技术粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA连接酶DNA克隆技术平端连接

AGCT

TCGAAluⅠDNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGADNA克隆技术目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录DNA克隆技术六、重组体的转化受体细胞转DNA克隆技术转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变DNA克隆技术CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌DNA克隆技术JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态DNA克隆技术转化后的克隆群体：DNA克隆技术含氨苄平板连接目的基因基因载体连接酶转化七、重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞DNA克隆技术（一）初筛：遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板DNA克隆技术2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H

片段COOH

片段DNA克隆技术X-galLacZ蓝色化合物X-galDNA克隆技术α互补的检测目录DNA克隆技术（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶DNA克隆技术（二）酶切鉴定凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒

重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段DNA克隆技术（三）DNA序列检测ACTGAAGGCTDNA克隆技术原位杂交（四）菌落杂交筛选法DNA克隆技术（五）免疫化学检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+DNA克隆技术

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线DNA克隆技术外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（E.coli）受体细胞表DNA克隆技术1E.coli表达体系优势：

一种成熟的基因克隆表达的受体细胞繁殖迅速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表达DNA克隆技术不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。DNA克隆技术2目的基因在E.coli中的高效表达三个因素：

强化蛋白质的生物合成抑制蛋白质的降解恢复蛋白质的空间构象DNA克隆技术3目的基因表达产物的检测1）蛋白质的PAGE对照样品MarkerDNA克隆技术2）表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达DNA克隆技术3目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白DNA克隆技术DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人