湖北省结核病防治研究所实验室诊断

结核病实验室诊断湖北省结核病防治研讨所周丽平2021年8月鲁进上传，以供学习结核分枝杆菌是结核病的致病因子与确诊根据，结核病实验室诊断就是用直接或间接的方法来证明患者体内存在结核分枝杆菌。在临床患者样本中寻觅结核分枝杆菌也就是实验室检测的主要内容。理想的诊断技术应该具有快速、特异、敏感、准确简便和价钱低廉的特点，这也是结核界近百年来技术研讨的方向。目前结核病实验室检查主要有：结核病的细菌学诊断〔涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分别培育、分枝杆菌药物敏感性实验、分枝杆菌菌种鉴定〕结核病的免疫学诊断〔皮肤结核菌素实验、结核抗体测定、结核抗原测定、细胞因子检测〕结核病分子生物学检测〔DNA探针技术、PCR测序、PCR定性检测结核分枝杆菌、双重实时荧光PCR技术和TaqMan探针技术及等温扩增技术〕，目前分子生物学检测技术开展非常快。结核病病理学诊断。根据国家和我省的“十二五〞结核病防治规划，要求100％的地〔市〕级结核病实验室具备药物敏感性实验才干、100％的区〔县〕级实验室具备分枝杆菌培育才干，同时根据我省“三位一体〞任务开展的实践情况，目前我省各级开展结核病诊断的实验室在涂片、培育、药敏实验方面才干还显缺乏。因此主要从细菌学诊断给大家做些引见，同时简介目前我国正在评价和推行运用的新诊断技术。抗酸菌涂片

涂片制备 每一张玻片都要编号 涂抹痰标本 自然枯燥 加热固定运用铅笔在磨砂面上编号运用竹木签进展涂抹不得运用火焰加热的方法加速痰膜枯燥×加热固定涂片太厚适宜太薄痰膜的厚薄好 零落好 不均匀适宜太厚太薄涂片厚度挑取了痰标本的脓性部分做螺旋状轨迹涂抹均匀大小约为2cmX1cm不要太厚透过染色前的痰膜可以隐约看到报纸上的字好的涂片Ziehl-Neelsen染色过程初染(碱性复红)脱色(盐酸酒精)复染(亚甲兰)

抗酸菌非抗酸菌碱性复红脱色Z－N染色原理－4复染染色过程将涂片排放在染色架上滴加碱性复红染色液，加热出现蒸汽后，坚持5分钟流水轻缓冲洗滴加脱色液，坚持1分钟流水轻缓冲洗滴加亚甲兰复染液，坚持1分钟流水轻缓冲洗将涂片排放在染色架上，留意间隔滴加碱性复红加热流水冲洗脱色-流水轻缓冲洗复染流水洗去复染液在玻片架上自然枯燥涂片抗酸染色检查方法Z－N染色步骤

操作流程涂痰膜自然干燥复红加热初染5分钟自然干燥镜检流水冲洗美兰复染30秒5%盐酸酒精脱色1-3分钟流水冲洗流水冲洗荧光染色0.1%金胺“O〞染液染色10分钟，水洗；3%的盐酸酒精脱色1-2分钟，直至无黄色可见，水洗；0.5%高锰酸钾溶液复染1-2分钟，水洗，晾干。检测用10倍目镜，40倍物镜，不加油。显微镜读片检查及结果报告单一的抗酸菌“V〞-字形成簇的抗酸菌复染太浓呵斥的影响适宜的复染萋尼氏法镜检结果报告规范阴性 未发现抗酸菌/300视野报告实践菌落数 1-8条/300视野(1+) 3-9条/100视野(2+) 1-9条/l0视野(3+) 1-9条/每视野(4+) 到达或超越10条/每视野报告1+至少察看300视野，2+至少察看100视野，3+以上至少50个视野荧光法镜检结果报告规范阴性 未发现抗酸菌/50视野报告实践菌落数 1-9条/50视野(1+) 10-49条/50视野(2+) 1-9条/每视野(3+) 10-99条/每视野(4+) 到达或超越100条/每视野报告2+至少察看50视野，3+以上至少20个视野分枝杆菌培育操作步骤对照标志的患者姓名，在生物平安柜内将约2ml痰标本置于相应的前处置管中；运用吸管，将与痰标本等体积4%NaOH参与前处置管中；旋紧处置管螺旋盖，接通涡旋振荡器电源，将处置管在涡旋振荡器上涡旋震荡30秒左右；假设以手持拿处置管，持拿方法是以拇指、无名指分别持拿处置管外壁，食指、中指按处置管螺旋盖。操作步骤将前处置管置于试管架内，置于生物平安柜内，室温静置15分钟；拧开罗氏培育管螺旋盖，检查培育基斜面底部的凝固水，假设凝固水过多，那么沿着斜面相对的一面的培育管内壁，将凝固水弃去。以无菌吸管汲取前处置后的痰标本，汲取时汲取的程度要小于挤压的程度，使吸管前端一段不含液体，防止液体不测滴落。操作步骤坚持培育基斜面程度或底端略高，均匀接种至酸性罗氏培育基斜面上，每支培育基运用接种2滴〔约0.1-0.15ml〕，接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培育基上部；将用过的吸管置于废液缸内；旋上培育管螺旋盖，不要太紧；悄然转动并放低培育管底部，使接种的液体均匀的在斜面上铺开。培育基置于恒温培育箱内，36±1℃孵育；操作

痰标本1－2倍4%NaOH振荡匀化静置15分钟

37℃竖直培育8周均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃程度放置24小时接种和孵育培育流程图

涡旋振荡1-2分钟痰标本中参与1-2倍体积4%NaOH分别接种0.1ml前处置液至2只培育基斜面接种后3天、7天察看，以后每周察看一次置37℃温箱培育有菌落生长需经抗酸染色确认，至第8周无菌落生长报告阴性室温静置15分钟4325671登记与报告

接种后第3和7日察看培育情况，以后每周察看一次，直至第八周末。每次察看后要在培育结果记录本上记录察看结果。无菌落生长报告培育阴性菌落生长不及斜面面积1/4时报告实践菌落数菌落占斜面面积1/4报告(1+)菌落占斜面面积1/2报告(2+)菌落占斜面面积3/4报告(3+)菌落布满培育基斜面报告(4+)初步断定、报告以药物敏感性测试为目的〔包括耐药性诊断和耐药监测等〕，不需求对培育物进展涂片检查，只需将培育物送至进展药物敏感性测试的实验室，并附培育物生长情况的报告单。以培育作为诊断或评价疗效为目的，需求对培育物进展涂片显微镜检查、鉴定，根据涂片和鉴定结果进展报告。培育物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形状、生长时间，报告：罗氏培育抗酸菌阳性经菌种初步鉴定，证明为结核分枝杆菌复合群后，报告：罗氏培育结核菌阳性菌落形状1、幼稚菌落比较小，外表光滑而有光泽呈黄色；成熟典型菌普通为中等大小或较大，枯燥粗糙，易碎，呈奶酪色，白色或橘黄色，不透明凸起菌落。2、不典型菌落为细小、园形、潮湿、易乳化、呈黄红色，普通7-10天内就成熟，常为非典型抗酸杆菌或非致病菌。假设发现培育基污染，按污染面积报告污染菌有明显界限，且不超越斜面面积1/4报告(C1+)污染菌有明显界限，且不超越斜面面积1/2报告(C2+)污染菌有明显界限，且不超越斜面面积3/4报告(C3+)污染菌没有明显界限或布满培育基斜面报告(C4+)

本卷须知留取标本后，尽能够立刻进展培育。假设不能立刻处置，应冷藏；将氢氧化钠分装成假设干小瓶〔小包装〕，每次运用新的氢氧化钠；假设只需一台生物平安柜，防止同时进展涂片和培育操作；在同一批处置的痰标本中，优先处置涂片阴性的标本，其次处置阳性级别低的标本，最后处置涂片阳性级别高的标本翻开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时防止猛烈震荡标本，震荡后静置几分钟，然后再翻开盖子本卷须知处置标本时，尽能够随时盖上容器盖子，防止在生物平安柜内敞开一切的标本容器用过的无菌吸管应置于废液缸中；正确标志培育管防止标本之间混淆；控制前处置去污染的接触时间，从向标本中参与氢氧化钠到接种时间不能超越20分钟，为此，当标本数量较多时，应分批处置，每批标本数量不超越6份为宜；本卷须知应将培育结果及时反响给临床医生。7天以内的结果察看中假设发现污染，应告知病人及时搜集另一份标本；假设发现快速生长分枝杆菌〔7天内长出的菌落〕。立刻报告结果并要求再搜集另一份痰标本。结核菌能够在3-4周内生长。发现菌落并鉴定后立刻报告结果。报告阴性培育结果时应孵育满8周。登记内容应包括：菌落初生长的日期以及阳性培育物的菌落特征;污染结果应随时检出并报告。常用的评价目的涂阳培阴率=培育阴性的病例总数/涂片检查阳性的病例总数*100%涂阳培阴率应<10%污染率=污染的培育管数量/培育管总数*100%污染率应<5%可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。标本选择不当选择标本中脓样、干酪样可疑部分过处理（时间、浓度)4％NaOH，1－2倍体积，20分钟接种量太小每管接种0.1毫升温箱温度不当温箱内置温度计，每日监测温度。涂阳培阴率过高？可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。前处理不充分4％，1－2倍，充分混旋，20分钟。材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。操作不当培训，预培养，严格按操作规程操作。培养基因素统一供应，4C直立保存，1个月内使用污染率过高？药敏实验目的：治疗，监测，诊断耐药主要就是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地域结核分枝杆菌的耐药程度。比例法Canetti,1963临界药物浓度〔单和多药物浓度〕临界菌群比＝耐药菌群数/全菌群数1%、10%…绝对浓度法Meisnner，1963临界药物浓度〔单或多药物浓度〕临界药物菌落数〔10、20菌落〕比率法Mitchson，1963RR=MIC被检菌/MICH37Rv常见几种法：比例法药敏实验的根本步骤含药培育基的制备菌液制备和稀释接种培育报告结果推荐浓度（ug/ml)药物LJ*7H107H11Bactec460MGIT960异烟肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0链霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺

NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星401.01.0卷须霉素

4010.010.01.252.5环丙沙星3.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫异烟胺5.010.02.55.0丙硫异烟胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0环丝氨酸40NRNRNRNR氨硫脲NRNRNRNRNR利奈唑胺1.01.0WHO引荐的DST培育基药物浓度(2007)药敏实验实验前物品预备一切实验用品必需无菌一切用品一次性拿入实验室，不要在实验过程中反复进出实验室实验菌株的预备一、临床标本初分别的菌株，假设具备以下特点，可直接用于药敏实验：1、出现肉眼可见菌落后1－2周的新颖菌落。2、没有其他污染菌共存。3、涂片确以为抗酸菌二、以下情况需求二次传代后才干进展药敏实验：1、固体培育基上生长老化的菌落。2、固体培育基上部分污染的菌落。药敏实验实验人员的平安防护：分枝杆菌药敏实验是对高致病性病原微生物的纯分别培育物进展操作，实验室实验人员进入药敏实验区须穿防护服、鞋套，实验中须戴手套、帽子、N95口罩。菌悬液制备预备磨菌瓶或磨菌管：磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个直径3mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。磨菌管为底部磨砂的玻璃管，带有与之匹配的磨砂玻璃棰〔磨菌棒〕，分别高压后方可可运用。菌悬液制备磨菌瓶法：在磨菌瓶中参与1~2滴10%吐温-80，用火焰消毒的接种环刮取2-3周的新颖菌落，置于磨菌瓶中。留意尽能够刮取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋0.5-1分钟。参与少许灭菌的PBS或生理盐水。将悬浊液转移至比浊管中，加生理盐水或PBS其浊度与规范麦氏比浊管〔MacFarlandNo.1〕一致，即得到1mg/ml的菌液。菌悬液制备磨菌管法向磨菌管中参与1滴10%吐温-80，用火焰消毒的接种环刮取2-3周的新颖菌落，放入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，参与少许灭菌PBS缓冲液或生理盐水，静止片刻，吸适量〔1-2ml〕至比浊管中，参与生理盐水直至其浊度与规范麦氏比浊管〔MacFarlandNo.1〕一致，即为1mg/ml的菌液。取菌磨菌菌液稀释每株菌事先预备好2个稀释管，然后用22SWG规范接种环或微量吸管汲取比浊好的菌液，无菌操作逐渐稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml。22SWG规范接种环：金属丝直径0.7mm，接种环内径3mm，1满环移液0.01ml。接种及培育用22SWG规范接种环分别沾取1环〔即0.01ml〕10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培育基外表，应留意使菌液尽能够均匀分散于培育基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。接种后的培育基置于37℃培育，至周围后报告结果。取菌液结果报告按以下方式记录菌落生长情况：少于50个菌落：实践菌落数50-100个菌落：1+100-200个菌落：2+大部分交融〔200-500个菌落〕：3+交融〔大于500个菌落〕：4+4周后察看结果，假设生长不良，可适当延伸但不能超越6周报告结果.〔耐药菌长的慢，药效丧失〕

结果计算计算耐药百分比：含药培育基上生长的菌落数耐药百分比=--------------------------×100%对照培育基上生长的菌落数假设耐药百分比大于或等于1%，那么以为受试菌对该抗结核药耐药。

结果记录方式对照SMINHEMBRFPKANOFX病人编号－4－6最终判断S/R菌浓度药物练习培养基菌浓度10－2菌浓度10－4耐药百分比（100％）对照4+50SM3+25？INH1+9？EMB20？RFP4+45？药敏接种预备质量控制假设高稀释度菌液〔10-4mg/ml〕在对照培育基上生长的菌落数少于20个菌落，那么应从对看管传代培育，反复实验。每批实验以结核分枝杆菌参考菌株〔H37Rv敏感株〕检测含药培育基的质量。本卷须知培育基制备－药物效价、保管与运用期限选择新颖、生长旺盛的菌落进展药敏实验，生长不良或陈旧菌株应传代后再进展实验比浊、菌液稀释应力求准确，以保证接种菌量的准确。以下操作应严厉按技术规范进展，防止产生气溶胶：挑取菌落、磨菌、菌液稀释和接种、烧灼接种环。实验后按要求处置废弃物和实验物品。比例法药敏实验流程对照培育基含药培育基药物储存液混合、摇匀根底液改良L-J100ml1ml磨菌分装凝固分装凝固1mg/ml菌悬液10-4mg/ml10-2mg/ml100倍稀释100倍稀释接种0.01ml接种0.01ml2-3周新颖菌落冻存分支杆菌的菌种鉴定〔初筛〕根据分支杆菌在一些特定培育基上能否生长的特性，将其初步鉴定为人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌和非典型分支杆菌。主要的培育基为PNB〔对硝基苯甲酸〕、TCH〔噻吩-2-羟酸肼〕培育基接种方法：用22SWG规范接种环沾取1环10-1mg/ml的菌液〔即0.01ml〕，用划线法均匀接种至PNB、TCH培育基外表，每管最终接种菌量为10-3mg/管。接种后的培育基置于37℃培育，至周围后报告结果。结果判别对照培养基PNBTCH人型+_+牛型+__非典型+++我国目前正在评价的新诊断技术卫生部-----盖茨基金会工程新诊断技术项目省地市级县级国家级二极管发光显微镜(LED)3----61等温扩增技术(LAMP)1----21线性探针(LPA)44-----1基因芯片(Genechip)4-----1多色巢式定量PCR(GenXpert)44-----1我国目前正在评价的新诊断技术卫生部----梅里埃基金会工程新诊断技术项目省地市级县级国家级二极管发光显微镜2----2等温扩增技术2----2线性探针2----2液体培养2----2r干扰素释放试验2基因分型11我国目前正在评价的新诊断技术实验方法医院数量MIGT960液体培养和固体培养的比较5卫生部----碧迪公司工程新方法用途LED(发光二极管显微镜)涂片检查LAMP(等温扩增)涂阴\涂阳LPA(线性探针)MDR-TB,鉴定Genechip(基因芯片)MDR-TB,鉴定GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂片阴性诊断涂片检查：LED荧光显微镜发光二极管〔LED〕荧光显微镜光源寿命长〔30,000h〕不需求预热不需求暗室可用现有的显微镜可运用电池电源与通常荧光显微镜的断定一致率98.0%〔n=1,326/内部资料〕FraenFluoLEDmodule两种方法察看结果Z-N染色镜检结果LED镜检结果中盖工程LED评价结果初诊患者LED涂阳患者检出率为14.96%〔552/3691〕，萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46%(460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点〔P=0.000〕随访患者LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%〔71/2509)，提高4.26个百分点〔P=0.000〕中盖工程LED评价结果读片时间LED读片时间120.03±38.88秒，明场显微镜206.31±75.86秒〔p=0.00〕运用接受度调查对于进一步推行建议，大多数(8/9)以为应进一步推行，但其中有2人以为应在日任务量大的实验室优先运用线性探针检测技术可检测能否感染结核杆菌可同时检测患者能否对利福平和异烟肼耐药约五小时内即可得到检测结果操作步骤检测步骤DNA提取：1~1.5hPCR扩增：2.5~3h探针杂交：2~2.5h结果判读：0.5h耐药分子诊断的根本原理利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。抗结核药基因基因功能利福平rpoB编码DNA依赖RNA聚合酶，参与mRNA转录过程异烟肼katG编码过氧化氢-过氧化物酶，参与INH体内的转化inhA编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的enoyl-ACP还原酶，参与脂酸的合成

中盖工程线性探针检测利福平评价

利福平线性探针传统药敏合计一致率灵敏度特异性PPV阳性预测值NPV阴性预测值耐药敏感合计耐药1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感4511271172合/p>

中盖工程线性探针检测异烟肼评价

异烟肼线性探针传统药敏总计一致率灵敏度特异性PPVNPV耐药敏感合计耐药1493017993.2%71.0%97.4%83.2%94.8%敏感6111081169合计21011381348

中盖工程线性探针检测MDR评价

MDR线性探针传统合计一致率灵敏度特异性PPVNPVMDR非-MDR合计MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8%96.8%非-MDR4012011241合计11912291348结核耐药检测基因芯片激光共焦扫描仪软件判读结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪通量：两个一线抗结核药速度：6小时〔比传统药敏实验法快50-100倍〕灵敏度：103CFU/反响特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分别株或者痰样本中结核杆菌多药耐药〔利福平、异烟肼〕。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2021〔IF=2.3〕96获国家医疗器械证书和欧盟CE认证基因芯片基因芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的外表，然后与已标志的待测生物样品中靶分子杂交，经过特定的仪器对杂交信号的强度进展快速、并行、高效地检测分析，从而判别样品中靶分子的数量。检测过程杂交反响杂交清洗清洗枯燥扫描检测数据分析检测分析PCR扩增DNA提取样品制备芯片结果图例芯片杂交质控芯片制备质控芯片制备质控芯片杂交质控靶基因扩增质控阴性对照质控空白对照质控产品指标基因芯片线性探针注册证书SFDA、CESFDA、CE产地中国德国用途从涂片阳性痰标本或培养物中检测对利福平和异烟肼的耐药性从涂片阳性痰标本或培养物中检测分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性检测原理耐药相关基因的突变耐药相关基因的突变（参考国际文献）检测方法反向杂交（斑点）反向杂交（slot\缝隙）需要仪器核酸提取仪、基因扩增仪、芯片杂交仪、芯片洗干仪和扫描仪超声水浴、基因扩增仪、杂交仪试剂储藏4℃和-20℃4℃和-20℃检测指标M.tb+16NTM种/群M.tb+13NTM种/群可扩展性强弱内部质控5种3种灵敏度102-103菌/ml[JCM,inrevision]

102-103菌/ml[JCM,2002]符合率三家医院，1724例，测序符合率100%分离株(157株)[JCM2008],(197株)[JCM2006],(219株)[CMI2006]。符合率分别为100%,,98.9%和88%

探针重复5次1次检测重复性10次重复，结果均正确无相关资料其他样本痰标本、分离株痰标本、分离株操作流程自动化高（杂交-清洗-扫描），省力，通量高，重复性好自动化低（杂交），费力，通量低，重复性稍差结果判读仪器扫描，软件自动判读杂交显示条带需黏贴比对，肉眼或自动判读，。成本相当（根据两家的市场价格和在疾病预防控制体系中应用的承诺价格）环介导等温扩增技术(LAMP)可同时检测患者能否感染结核对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备极其简单PCRLAMP・需求运用PCR扩增仪・针对基因设计的特异性的两条引物・扩增效率:107・不需求运用PCR扩增仪・多对引物保证了扩增的特异性・扩增效率:1010扩增原理操作流程抽提基因组DNA扩增管去除杂质将纯真DNA转入扩增管痰血液咽试子标本类型样品处置在几分钟内就可以完成＋－Genexpert检测技术可同时检测患