【生物课件】重组DNA技术的基本工具 2023-2024学年高二（人教版2019选择性必修3）

教学目标：1、阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2、认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3、进行DNA的粗提取与鉴定教学重点：1、重组DNA技术所需的三种基本工具的作用

2、DNA的粗提取与鉴定。教学难点：

1、基因工程载体需要具备的条件。2、DNA的粗提取与鉴定。图解“基因工程实质”转移A生物B生物萤火虫普通动植物发光基因基因工程的概念指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。基因工程的诞生和发展转基因抗虫棉苏云金杆菌中的Bt基因基本原理普通棉花细胞含Bt基因的棉花细胞能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株转入植物组织培养技术形成转基因抗虫棉对转基因工程的分析苏云金杆菌中的Bt基因基本原理普通棉花细胞含Bt基因的棉花细胞能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株转入植物组织培养技术形成目的基因1受体细胞2目的基因表达产物3两个关键环节4在实验中研究或操纵的可以带来预期性状的基因用来接受目的基因以定向改造某种性状的细胞目的基因在受体细胞中转录和翻译出来的产物不同来源的DNA进行重新组合形成一个DNA重组的DNA分子在受体细胞里能表达出产物操作原理操作对象操作水平操作环境操作结果工程优点基因重组基因DNA分子水平生物体外获得新的生物类型和生物产品克服远缘杂交不亲和的障碍定向改变生物的性状基因工程诞生的理论基础拼接的基础1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息的传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码基因在空间上转移并成功表达接剪运1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构表达的基础1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码重组DNARNA蛋白质性状复制转录翻译翻译拼接的基础第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具转基因抗虫棉接剪运限制性内切核酸酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”一、限制性内切核酸酶（限制酶）1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。2、作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。1’2’3’4’5’

G1’2’3’4’5’

A磷酸二酯键TGCCGTAA5'3'5'3'3、作用位点：

只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。EcoRI(在G与A之间切割)SmaI(在G与C之间切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端一、限制性内切核酸酶（限制酶）

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。一、限制性内切核酸酶（限制酶）4、作用结果：形成黏性末端和平末端限制酶所识别的序列的特点是：

呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。在切割部位，一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链5’往3’读的顺序完全一致暮天遥对寒窗雾；雾窗寒对遥天暮。写出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC总结

不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端同尾酶

识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶限制性核酸内切酶的命名限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。从大肠杆菌（Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIII1、你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。2、试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？原核生物中不存在该酶的识别序列，或识别序列已被修饰使限制酶不与之结合旁栏思考题二、DNA连接酶——“分子缝合针”1、作用：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。2、实质：

恢复两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶注：DNA连接酶不作用于氢键二、DNA连接酶——“分子缝合针”类型E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能只缝合____________

缝合____________和____________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯键思考T4DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同吗？不同，因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。3、种类和作用：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?DNA连接酶AG

T

AC

TA

A

T

DNA母链DNA聚合酶DNA聚合酶T……T……A……A……T……A……T……C………G………旁栏思考题项目DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键DNA连接酶与DNA聚合酶的比较与DNA相关的五种酶的比较酶1酶2酶4酶3酶5酶1:限制酶酶2:DNA连接酶酶3:DNA解旋酶酶4:DNA聚合酶酶5:DNA水解酶三、基因进入受体细胞的载体1、作用：将外源基因送入受体细胞2、种类：①质粒——最常用拟核DNA质粒大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制起点裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。②噬菌体、动植物病毒等动物病毒噬菌体种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别三、基因进入受体细胞的载体拟核DNA质粒大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制起点大肠杆菌及质粒结构模式图三、基因进入受体细胞的载体3、作为载体需要具备的条件：②自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制①有一个至多个限制酶切割位点④对受体细胞无害③具有多种特殊的标记基因如：抗生素抗性基因；荧光蛋白基因思考·讨论：重组DNA分子请你在上述序列中EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？

根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。目的基因和载体随意连接（反向连接）、目的基因自身环化4.用同一种限制酶切割目的基因和载体在连接过程中可能出现什么问题？思考·讨论：重组DNA分子注：选择限制酶的要求①选目的基因两端和载体都有的酶切位点，确保出现相同的黏性末端②所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因③选择两种限制酶的优点：防止目的基因和载体自身环化、反向连接探究·实验DNA的粗提取与鉴定DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，选择适当的物理或化学方法进行提取。1、提取DNA的思路：2、提取DNA的原理：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。3、鉴定DNA的原理DNA

+二苯胺试剂蓝色沸水浴一、实验原理：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA注意：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用探究·实验DNA的粗提取与鉴定1、选材：二、材料用具：2、试剂：探究·实验DNA的粗提取与鉴定探究·实验DNA的粗提取与鉴定三、方法步骤：研磨30g洋葱（切碎）+10mL研磨液→充分研磨提取上清液方法：①纱布过滤：过滤→4℃冰箱冷藏→取上清液②离心：1500r/min，离心5分钟→取上清液上清液：除DNA外，还有核蛋白、多糖等杂质探究·实验DNA的粗提取与鉴定三、方法步骤：研磨提取上清液析出DNA方案一上清液中+等体积、预冷的95%酒精溶液

→静置2～3min

→出现白色丝状物→用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分方案二离心管

→10000r/min，离心5min→弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干探究·实验DNA的粗提取与鉴定三、方法步骤：研磨提取上清液析出DNADNA的鉴定2mol/LNaCl溶液2mol/LNaCl溶液(加入丝状物或沉淀物)1.你提取出的白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？观察提取到的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。

二苯胺试剂鉴定呈蓝色说明实验成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。四、结果分析与评价：探究·实验DNA的粗提取与鉴定3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因？本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。四、结果分析与评价：探究·实验DNA的粗提取与鉴定本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法