食品安全学实验指导

食品安全学实验指导宁喜斌2007年4月5※〈刖言〉随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。社会对食品安全的专门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全专业。《食品安全学》作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员编写这本实验指导，供同学们参考。本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评指正，以便我们能够及时进行修正。编者2007年4月5※〈目录〉实验一食品中金黄色葡萄球菌的检验实验二食品中沙门氏菌的检验实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）实验四PCR技术快速检测副溶血弧菌实验五3M大肠杆菌和大肠菌群快速检验实验六对硫磷在苹果中残留的分析方法实验七食品中药残的快速检测5※〈实验一＞实验一食品中金黄色葡萄球菌的检验一、 实验目的学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。二、 基本原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品（剩饭、糕点、牛奶肉品等）以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。三、 设备和材料实验器材：显微镜、恒温培养箱(37C)、冰箱、移液管(ImL、5mL、10mL)、试管(15x150mm)、锥形瓶(250mL、100mL)、培养皿、L型涂布棒、酒精灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管(3x50mm)实验材料：污染牛奶等。四、 培养基和试剂胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、Baird-Prker琼脂平板、营养肉汤、0.85%灭菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色剂五、 操作步骤1.检样处理：吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。增菌培养增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，置36±LC温箱培养24h,转种血平板和Baird-Parker平板，36±C培养24h,挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。形态观察：本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5-1“n。在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。血浆凝固酶实验吸取1：4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1C温箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。直接计数方法吸取上述1：10混悬液，进行5倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL,分别加入三块Baird-Parke评板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36±"C温箱1h，寺水分蒸发后反转平皿置36±"C温箱培养。在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选1个菌落，接种血琼脂平板，36±C24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。六、 实验报告1．鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。2．对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数5※〈实验一＞实验二食品中沙门氏菌的检验一、 实验目的学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。一、 基本原理沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节，特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。受到污染的食品，不仅直接影响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些食品必须检查沙门氏菌。食品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。沙门氏菌在各种选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。三、 设备和材料实验器材：恒温培养箱(37C.42C).显微镜、广□瓶(500mL)、移液管(10mL)、锥形瓶(250mL)、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株四、 培养基和试剂缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、DHL琼脂、HE琼脂、WS琼脂、SS琼脂五、 操作步骤前增菌和增菌：吸取检样25mL，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广□瓶内，于37C培养4h,移取10mL,转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42C培养18 24h。同时，另取10mL，转种于lOOmL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37C培养1824h。分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板、HE琼脂平板、WS和SS琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于

36±C分别培养18—24h亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS）或40_48h（BS）,观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌I、II、IV、V、YI和沙门氏菌III在各个平板上的菌落特征见表1。表1沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌I、II、IV、V、YI沙门氏菌III（即亚利桑那菌）亚硫酸铋琼脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌I、II、IV、V、VI相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色YimYim111?(II?俵俵asHM蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与沙门氏菌I、II、IV、V、V相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区分六、 实验报告辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。5※〈实验三 >

实验三酶联免疫吸附试验（间接ELISA）一、目的要求了解ELISA的基本原理，及其优缺点。掌握间接ELISA法的试验操作过程。二、 基本原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentas，0简称ELISA）是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。ELISA的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用ELISA检测仪，即酶标测定仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具特异、敏感、结果半段客观，简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用oELISA类型繁多，国内已有市售，可根据需要选用，按说明书操作。三、 器材1.血清兔阴性血清2.溶液或试剂⑴包被液（0.05mol/l,Ph9•的碳酸盐缓冲液）：NaCO31.59g,NaHCO32.93g,加去离子水定容至lOOOmL（加入0.5%的甲醛，4©可保存约2周），现配现用。⑵PBST洗涤剂（吐温-磷酸盐缓冲液pH7.4）：NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4・2H2O2.9gKCl0.2g吐温-200.5mL，蒸馏水加至100mLl。⑶磷酸盐诗宁檬酸缓冲液（PH5.0）:分别取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加去离子水定容至100mLlo甲液（0.01mol/的柠檬酸C6H8O7・2。）：称取C6H8O7・2O19.2g，加去离子水定容至1000mLo乙液（0.2mol/的磷酸氢二钠Na2HPO412H20）:称取Na2HPO412H2O71.7g加去离子水定容至1000mLlo用前加入150“Ll30的H2O2,现配现用。⑷底物溶液：40mg邻苯二胺溶于1000mLpH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，临⑸终止液2mol/LH2SO4：吸取10.66mL的98%浓H2SO4（密度为1.84g/mL）加去离子水定容至100mL0⑹酶标二抗（山羊抗兔Ig-HRP）稀释液：分别吸取用前加入150“Ll30的H2O2,现配现用。仪器或其他用具聚苯乙烯微量反应板，酶标仪，吸管，橡皮吸头等，紫外分光光度计，20“L、100“L、500ML移液枪各一只，ELISA试剂盒。四．操作步骤1.包被抗原

用lOOuL移液枪吸取用包被液稀释好的金黄色葡萄球菌抗原，沿孔壁准确滴加100uL至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置37C过夜。2.洗板倒出包被液，用另一根习惯吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。均匀振荡3min,甩出洗涤液。再加洗涤液，重复上述操作三次,扣干。3.加血清用二根套有橡皮吸头的0.2mLl吸管，小心吸取稀释好的血清（待检、阳性、阴性血清），准确加100uL于对应板孔中，第4孔中加100uL的PBST洗涤液，37C放置lOmin,在水池边甩出血清，洗板三次（方法同2）。注意：切忌溢出互混！加酶标抗体用吸管沿孔壁上部小心准确加入lOOuL酶标抗体（不能让血清玷污吸管），37©放置lOmin,同上倒空，洗涤三次。加底物中，每孔O.lmL。置37C，显色5_15min（经常观察），待对照有明显颜色后,按比例加h2中，每孔O.lmL。置37C，显色5_15min（经常观察），待对照有明显颜色后,6.判断结果肉眼观察（白色背景），阳性对照孔应明显黄色，阴性孔应无色或微黄色，待测孔颜色深于阳性对照孔则为阳性；酶标仪测定，酶标仪测定波长取久=492nm（适用于底物为OPD）, P/N〉2.1时阳性，P/N<1.5阴性，2.1>P/N〉1.5可疑阳性，应予复查o（P/N=检测孔OD值啞白孔OD值/阴性孔OD值啞白孔OD值。）滴加试剂量要准,且试剂不可从一孔流到另一孔中；每种试剂对应一种吸管，不能混淆。底物溶液中的h2管，不能混淆。底物溶液中的h2o2要临用时再加，否则，放置时间过长,影响试验结果判定。五．实验报告1•结果运用图示表现你所进行的ELISA的反应原理，并写出实验结果。2.思考题（l）ELISA实验过程中,洗板这一步骤能否省去,为什么？（2）酶底物溶液为什么需要现配现用？5※〈实验四〉实验四PCR技术快速检测副溶血弧菌一、实验目的学习副溶血弧菌DNA的提取方法学习副溶血弧菌的PCR检测方法二、 基本原理副溶血弧菌是弧菌的一种，主要存在于海洋中，是一种致病菌。人类会因进食未煮熟的海产品或被该菌污染的食物而感染，引起食物中毒。PCR是利用基因扩增技术，具有特异、敏感、快速的分子生物学方法，该技术在微生物、分子流行病学及疾病诊断灯方面的应用显示出极大的优越性。16SrDAN具有分子大小适中，突变率小等优点，素有"细菌化石"之称，常被用于细菌分类及分子系统发育树的建立。本次实验利用16SrDAN的通用引物，进行PCR扩增，来检测副溶血弧菌。三、 设备和材料实验器材：PCR扩增仪、电泳仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱(300、酒精灯、培养皿、试管(15X150mm)、接种环、离心管(1.5mL)、一次性手套、—次性□罩、移液枪(1—10“L、10—100“L)、枪头(0.5—10“L、1—200ML)、配套枪头盒、显微镜、载玻片、灭菌锅、试管架、试管篓实验材料：副溶血弧菌24h培养物四、 试剂DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、引物(27f、1492r)、琼脂糖、EB染色液、DNAMarkerTAEPCR电泳缓冲液、革兰氏染色液、TCBS培养基、3%NaCl营养肉汤、生理盐水五、 操作步骤1．培养基培养：取副溶血弧菌24h培养物分别接种在TCBS培养基以及3%NaCl营养肉汤中，30©培养24h。2．镜检：取固体培养基上的菌体进行革兰氏染色，观察具体形态，副溶血弧菌为革兰氏阴性菌，在油镜下观察，菌体弧状，0.5X1.5—3.0微米，单个或偶尔联成S形。3．DNA提取：取液体培养物进行DNA提取，按照DNA提取试剂盒说明操作。4．DNA扩增：利用细菌16SrDNA的通用引物来进行DNA扩增。总体积25“1的反应体系中，10“mol/L的上下游引物各1mL,模板DNA1“L,Mg+1.5“L,dNTP2.5“L,Taq酶0.3“L,10Xbuffer缓冲液2.0mL，双蒸水15.2“L。引物序列为：27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492r：GGTTACCTTGTTACGACTTPCR反应条件为：预变性95C3min，变性95C1min，退火55C1min，延长72C2min,30个循环，再延长72C10mino5．电泳检测：餐饮业管理与学习取15“l扩增液经2%琼脂糖凝胶及TAE电泳缓冲液电泳90min,在EB染色液中染色30min,然后漂洗，用凝胶成像仪观察结果并拍照。六、 实验报告观察扩增后的DNA条带，根据Marker判断其DNA大小。5※〈实验五〉实验五3M大肠杆菌和大肠菌群快速检验一实验目的掌握利用3M测试片快速检测大肠杆菌的方法。二基本原理PetrifilmColiformTMColiform测试片含有VRB培养剂(VioletRedBile)，—种冷水可溶性的凝胶剂和四唑翁(tetrazollium)指示剂，可增强菌落计数效果。绝大多数E.coli(约占97%)能产生-葡萄糖甘酸酶与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖的大肠菌群产生的气体，约有95%的大肠杆菌产生，形成蓝色或深蓝上菌落并有气泡相连接，气泡大小约为1个菌落直径。AOAC和FDA细菌学分析手册(RAM)规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖产酸产气。大肠菌群菌落在PetrifilmCC测试片上生长产酸，PH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群细菌。设备和材料3M公司的Pertrifidm丄VrM牡孕操作步骤(1)样品准备称取或吸取食品样品，置于适宜的无菌容器内，加入适量无菌稀释液搅拌或均质样品。接种将测试片放置在平坦表面处，揭起上层膜，使用吸管将ImL的样品垂直滴在测试片的中央处。将上层膜缓缓盖下，避免气泡进入，切勿让上层膜直接盖回。使用压板(平面底朝上)放置在上层膜中央处，轻轻压下，切勿扭转或滑动压板。静止1min使凝胶凝固。培养测试片的透明的一面向上，可堆叠至20片，于35C±或37C±下培养24h±2h(培养后的菌落在测试片上可能看不到，因为指示剂是含在金黄色葡萄球菌检测反应片上)。将检测片移至62C±2C培养箱，培养lh4h(注意：如果菌落需要进一步测试，检测片培养不要超过lh)。使用无菌镊子取出圆形的

反应片，再揭开上层覆盖膜小心置入反应片。再将上层膜放下（为了使反应片与培养胶均匀接触及避免夹带任何气泡，可用一弯曲的玻璃棒（L玻棒）轻压检测片）。将已置入反应片的金黄色葡萄球菌检测片培养于35C±1C或37C±1C,13h。将测试片置于平坦表面使用吸管将ImL样液垂细心将上层膜缓慢盖下,处，揭开上层膜 直加在测试片的中央处避免有气泡产生,切勿使上层膜直接落下轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的拿起压板，静止至少1分钟以使培养培养面积上，切勿扭转样板 基凝固测试片的透明面朝上，可可目视及用标准菌落计可以分离菌落作进一步堆叠至20片 数器或其它的照明放大鉴定，即掀起上层膜，由镜计数，并可参考判读卡培养胶上挑取单个菌落计算菌落数图13M测试片的操作方法四检测结果的判读卡和计算菌落数方法AOAC和FDA细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖产酸产气。大肠菌群菌落在Pertrifi测试片上生长产酸，pH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群。具体判定方法参见图2。大肠菌群菌落总数=69大肠菌群菌落总数=69大肠菌群鉴定方法，在不同国家可以有变更（见培养时间和培养温度提示）。AOAC确认大肠菌群菌落总数为69（有气泡的菌落）无生长=0注意图2-5培养基颜色的变化，随着大肠菌群菌数增多，培养基颜色变深,背景的泡（沫）为培养对象，不是大肠菌群生长结果大肠菌群菌落总数=79大肠菌群菌落总数=79Petrifilmcc测试片菌落数适宜计数范围是15-150，不要计算圆形培养基外的菌落，因为泡棉上已不含选择性培养基（圆圈1）估计的大肠菌群菌落总数=220测试片面积为20cm2，当菌落数超过150个，为了估计菌落数可选择其中一个或数个有代表性菌落的小方格（1cm2）计算平均菌落数，再乘以20方得到整个测试片上的菌落数。菌落太多时需进一步稀释样品，方能获得准确计数大肠菌群菌落总数=TNTC（菌落太多无法计数）Petrifilmcc测试片菌落无法计数时至少有下列现象之一：①有很多小菌落；②有许多气泡；③培养的颜色深暗大肠菌群菌落总数大肠菌群菌落总数=TNTC（菌落太多无法计数）Petrifilmcc测试片菌落无法计数时至少有下列现象之一：①有很多小菌落；②有许多气泡；③培养的颜色深暗大肠菌群菌落总数=4当有大量的非大肠菌群细菌如假单胞菌属存在时，Petrifilmcc测试片培养基颜色呈黄色大肠菌群菌落总数=2食物颗粒为不规则形状，且不带气泡大肠菌群菌落总数=2食物颗粒为不规则形状，且不带气泡气泡可有不同形状，气泡可使菌落撑散，使菌落轮廓似气泡（见圆圈1和圆圈2），人为的气泡可能是不当的操作所致，或是来自样品里的气体，它们呈不规则形状，且不与菌落相连接（见圆圈3）图2大肠菌群检测的判读卡和计数方法实验报告培养后，判断大肠杆菌菌落并计数。5※〈实验六〉实验六、对硫磷在苹果中残留的分析方法一、目的1.学习农药残留样本预处理、净化、浓缩等操作技术。