谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶的影响研究

福建农林大学本科毕业论文论文题目：谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶的影响研究学院：资源与环境学院专业年级：2010级环境工程学号：姓名：指导教师、职称：2014年5月27日College：_________Collegeofresourcesandenvironment__SpecialtyandGrade：___Environmentalengineering___Number：__Name：________________Advisor：____ZhengYaotong(Professor)__Submittedtime:_____May27,2014___目录TOC\o"1-3"\h\u6298摘要： 谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶的研究摘要：为了了解谷氨酸对白腐菌合成锰过氧化物酶作用和谷氨酸对白腐菌生长的作用。以黄孢原毛平革菌pc530、pc5305及杂色云芝TvR4为研究对象，将三种微生物在含不同浓度谷氨酸的培养基中连续培养12天，每隔24小时的测定锰过氧化物酶酶活及白腐菌生物量变化。结果显示，谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶有抑制作用；黄孢原毛平革菌突变菌株PcR530、TvR4比野生菌株Pc530在产锰过氧化物酶方面有更优良的性能；谷氨酸对白腐菌的生长具有促进作用；锰过氧化物酶是白腐菌Pc530的次级代谢产物。关键词：白腐菌、谷氨酸、锰过氧化物酶Abstract:InordertounderstandtheinfluenceofGlutamatetowhite-rotfungusproduceMnpandwhite-rotfungus’biomass.Thepc530、pcR5305andTvR4asthereasearchobject,Threekindsofmicrobeinmediumcontainingdifferentconcenttationsofglutamatecontinuorscultivationof12daysdifferentconcenttationscontinuous.Every24hoursofeterminationofmanganeseperoxidaseenzymeactivityandthechangeofwhite-rotfungusbiomass.Resultshowthat,Glutamateinhibitionofwhite-rotfungusproduceMnp;PcR530、TvR4arebetterthanPc530atwhite-rotfungusproduceMnp;Glutamatepromotewhite-rotfungusgrowing;MnpisthePc530’ssecondarymetabolites.Keywords:white-rot;glutamate;Mnp引言：木质素是一种高度复杂的不定型的芳香族化合物，是仅次于纤维素的第二大再生有机资源。木质素是一类由苯酚和非苯酚结构单元通过醚键和碳碳键等连接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在组分种类和连接键类型方面的多样性，意味了结构的异质性与不规则性，也决定了对其进行生物降解的复杂性和特殊性[1]。白腐菌是指一类具有相同功能即引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。凭其选择性降解木质素的能力，白腐菌的菌丝穿入木质，侵入木质细胞内，释放酶，导致木质腐烂成为淡色海绵状团块--白腐[2]。白腐菌是自然界中最有效的木质素降解物。锰过氧化酶（Mnp,EC3）即是白腐菌中最重要的一种酶之一，是几乎所有的木生白腐菌和各种土壤中的枯叶分解真菌所产生的，是最为普遍的木质素修饰过氧化物酶。由于MnP的底物专一性较弱，可氧化各类芳香族化合物及一些难被生物降解的物质，因而具有极高的工业应用潜力，可在生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污染物的降解和环境的生物修复等方面得到有效的应用，另外在褐煤的生物转化过程中起重要的作用，可减少能源浪费和环境污染[2、3]。目前，锰过氧化物酶的主要生产菌株是白腐菌[4]，白腐菌产生的胞外木素降解酶通常为次级代谢酶，产酶周期长，且产酶量很低，直接影响到该酶的实际应用，使锰过氧化物酶的工业化生产受到限制[5]。因此，能否使白腐菌的锰过氧化物酶在工业及环境治理领域得到应用，研究白腐菌的培养条件对产锰过氧化物酶的影响具有关键作用。本文探讨了白腐菌在相同的生长培养基中加入不同浓度谷氨酸的生长规律，研究谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶的影响进行了初步研究，从而进一步探索在谷氨酸存在条件下如何提高白腐菌产锰过氧化物酶的产酶效率。1.材料与方法1.1实验材料1.1.1实验菌种本次实验用到了实验室保存的白腐真菌模式菌种黄孢原毛平革菌黄(Phanerochaetechrysosporium),编号为pc530，及其通过诱变产生的菌株，标号为pcR5305；以及杂色云芝(Coriolusversicolor)，编号TvR4。1.1.2培养基培养基：PDA固体培养基、液体富氮基本培养基（1）PDA固体培养基（土豆蔗糖琼脂培养基）即土豆20%，蔗糖20%，琼脂20%[6]。1210C灭菌15min；灭菌后将培养基凉至500C左右，终浓度为0.5mmol/L；pH自然。液体基本培养基：以Kirk液体限氮基本培养基为基础，对其进行了改良，其成分如下：①碳源-葡萄糖10g/L;②氮源-酒石酸胺0.77g/L；③基本盐（g/L）：KH2PO47、MnSO4·7H2O1.75、CaCl20.35、VB10.001,微量元素溶液24.5ml；④缓冲液-0.2mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液50ml（pH4.5）；⑤微量元素溶液（g/L）：甘氨2.1,MgSO4·7H2O10.5,MnSO4·H2O0.035,NaCl3.5,FeSO4·7H2O0.35,CoSO4·7H2O0.35,CaCl2·2H2O0.35,ZnSO4·7H2O0.35,CuSO4·5H2O0.035，AlK(SO4)2·12H2O0.035,H3BO30.035,NaMoO4·2H2O0.035；⑥pH值：调节4.5[7]。1.1.3实验仪器立式压力蒸汽灭菌锅、SE93—1自动双重纯水蒸馏器、SW—CJ—1F型单人双面净化工作台、可见分光光度计、PHX型智能升华培养箱、电子天平、HH—4数显恒温水浴锅、全温摇瓶柜、PHS—25数显pH计、温度数显调节仪、电热鼓风干燥箱、立式冰箱、干燥器。1.1.4药品谷氨酸粉末、琼脂、酒石酸铵、葡萄糖、磷酸二氢钾、酒石酸钠、MgSO4·7H2O、CaCl2、醋酸、醋酸钠、甘氨酸、MnSO4、30%过氧化氢、NaCl、CuSO4·5H2O、ZnSO4、硫酸钴、硫酸铝钾、硼酸、维生素B1、FeSO4、ABTS、无水乙酸钠、冰醋酸.1.1.5酶活测定实验试剂50mmol/L乳酸-乳酸钠缓冲液（pH4.5）：分别配置50mmol/L的乳酸钠和乳酸溶液，然后用乳酸溶液调乳酸钠溶液的pH为4.5。1.6mmol/L的MnSO4溶液：称取MnSO40.0676g,用蒸馏水定容至250ml。1.60mmol/L的H2O2溶液：用微量进样器（100ul）移取45.6ul30%的溶液，然后用蒸馏水定容至250ml。1.2实验方法1.2.1培养基的配置及接种将白腐菌TvR4(杂色云芝)、pcR5305、pc530接种在固体PDA培养基上,置于300C恒温培养箱中培养至长满固体培养基。在三缸液体配置好的培养基中加入0、2、10mg的谷氨酸粉末，摇匀后把三缸液体培养基分装于108个250毫升三角烧瓶中，每瓶装100毫升。将324瓶三种不同浓度的培养基标记好它的浓度和即将接种的菌种，并其置于高压蒸气锅中灭菌1小时，待其冷却后即可接种。在三种同浓度谷氨酸培养基中分别按标签对其进行接种，培养基的250mL三角瓶中，控制每瓶约为1.0xl07个孢子的相同接种量，即每瓶接1m2的两个菌饼。还要有3个重复，接种时要避免细菌污染。还要保持菌种菌丝面朝上，保持其处于有氧状态，尤其是pc530和pcR5305。37oC温静置培养，每隔24h取出1瓶发酵液测定其生物量及产酶活性。1.2.2粗酶液的制备及生物量的测定三角烧瓶中的三种菌种三种谷氨酸浓度的微生物各1瓶共9瓶分别置于九个漏斗上进行过滤，滤液即是所需的粗酶液。过滤好粗酶液后，将残留在滤纸上的微生物连同滤纸一起在800C的烘箱中烘干，烘干后的滤纸同微生物干重M2减去之前记录好的干滤纸重M1，即为微生物的重量M[8]。做完后再做两组平行试验。1.2.3锰过氧化物酶（MnP）酶活的测定取50mmol/L的乳酸-乳酸钠缓冲液（pH4.5）3.4ml,1.60mmol/L的MnSO4溶液0.1ml，0.4ml的粗酶液，放在7mlLEP管中，震荡均匀，室温下加入1.60mmol/L的H2O2溶液0.1ml启动反应，测反应最初3min内λ=240nm处吸光度变化，以0.1ml缓冲液代替MnSO4做空白对照，1个酶活力单位用每分钟吸光值增加0.1的酶量来表示。MnSO4的ε240=8100mol-1·cm-1[9]。做完后再做两组平行试验，将实验结果取平均值。2结果和分析2.1相同微生物不同浓度谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶酶的影响上图为野生菌株Pc530随谷氨酸浓度变化锰过氧化物酶酶活的变化图。可以看出，3种浓度下该菌都在第5天左右开始产过氧化物酶，在5-7天内上升速率比较快，随之减缓，快到峰值时有所减慢。达到峰值后锰过氧化物酶的活性有所下降。在第9天达到最大值，含0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸培养液的酶活最大值分别为630U/L、600U/L、570U/L可以看出，随着谷氨酸浓度的增加Pc530产锰过氧化物酶受到了抑制。上图为突变菌株PcR5305随谷氨酸浓度变化锰过氧化物酶酶活的变化图。其在第1天就开始产锰过氧化物酶，酶活在第6天达到最大值。含0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸培养液的酶活最大值分别为1500U/L、1440U/L、1440U/L，随着谷氨酸浓度的增加PcR5305产锰过氧化物酶受到了抑制。上图为杂色云芝TvR4随谷氨酸浓度变化锰过氧化物酶酶活的变化图。该菌种在第1天开始产酶，酶活先较快上升，随之减缓，快到峰值时有所减慢，第6-7天左右达到最大值。含0mg/L、2mg/L谷氨酸的培养液在酶活第7天达到最大值，酶活分别为1800U/L、1740U/L；含10mg/L谷氨酸的培养液的酶活第6天达到最大值，值为1710U/L。该菌种随着谷氨酸浓度的增加，杂色云芝TvR4产锰过氧化物酶受到了抑制。2.2同种谷氨酸浓度下不同微生物对白腐菌产锰过氧化物酶的影响上图为在0mg/L谷氨酸浓度下pc530、pcR5305、TvR4三种微生物产锰过氧化物酶的特性曲线。由图可知pcR5305、TvR4都在第1天产酶，分别在第6天和第7天的酶的活性达到最大值，最大值分别为1500、1800。Pc530在第5天才开始产酶，在第9天达到最大值630。可以发现PcR5305、TvR4的开始产酶和酶活达到最大值的时间都比Pc530早，酶活的最大值也远高于Pc530。上图为在2mg/L谷氨酸浓度下pc530、pcR5305、TvR4三种微生物产锰过氧化物酶的特性曲线。由图可知pcR5305、TvR4都在第1天产酶，分别在第6天和第7天酶的活性达到最大值，最大值分别为1440、1740。Pc530在第5天才开始产酶，在第9天达到最大值600。可以发现PcR5305、TvR4的开始产酶和酶活达到最大值的时间都比Pc530早，酶活的最大值也远高于Pc530。上图为在10mg/L谷氨酸浓度下pc530、pcR5305、TvR4三种微生物产锰过氧化物酶的特性曲线。由图可知pcR5305、TvR4都在第1天产酶，在第6天酶的活性达到最大值，最大值分别为1410、1710。Pc530在第5天才开始产酶，在第9天达到最大值570。可以发现PcR5305、TvR4的开始产酶和酶活达到最大值的时间都比Pc530早，酶活的最大值也远高于Pc530。2.3谷氨酸对生物量的影响上图是pc530在不同谷氨酸浓度培养条件下的生物量曲线图，生物量出现最大值是在第7天左右，0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸的生物量分别是0.6044g、0.6729g、0.6996g。可以看出随着谷氨酸浓度的增加生物量增大。上图是pcR5305在不同谷氨酸浓度培养条件下的生物量曲线图，生物量出现最大值是在第4天左右，0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸的生物量分别是0.1726g、0.2499g、0.2933g。可以看出随着谷氨酸浓度的增加生物量增大。上图是TvR4在不同谷氨酸浓度培养条件下的生物量曲线图，生物量出现最大值是在第4天左右，0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸的生物量分别是0.2008g、0.2615g、0.2933g。可以看出随着谷氨酸浓度的增加生物量增大。2.4生物量与锰过氧化物酶生成量的关系同时通过Pc530的生物量及产酶的曲线图对比分析，Pc530生物量最大值出现在第7天左右，酶活最大值出现在第9天左右。生物量达到最大值，即开始处于稳定期后酶的活性才快速增长。3.结果与讨论3.1谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶有完全抑制作用谷氨酸浓度越高三种白腐菌产锰过氧化物酶的酶活越低，说明谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶具有抑制作用。已有的研究结果表明，锰过氧化物酶的合成受碳源和氮源的限制。高碳低氮培养基有利于锰过氧化酶的合成，高浓度氮对酶的合成有抑制作用，这种现象叫“氨代谢物抑制”[3]。白腐菌代谢谷氨酸，NH4+是其中的产物[10]。谷氨酸浓度增加，白腐菌代谢产生的NH4+浓度增加，由于氨代谢抑制，锰过氧化物酶的活性就越受到抑制。国外一学者已证明了此结论[11].具体机制李慧蓉研究在黄孢原毛平革菌产锰过氧化物酶的篇中提到，氨基酸对Mnp的合成具有抑制作用，谷氨酸属于一种氨基酸。其抑制机理与漆酶对苯丙氨酸的抑制机理类似，黎芦醇VA是黄孢原毛平革菌次生代谢物，其生物合成受到含氮化合物的抑制。而谷氨酸是VA生物的合成的前体物；谷氨酸解氨酶通过对谷氨酸的解氨作用，在为VA的合成提供原料而参与VA合成的起始步骤的同时，将谷氨酸中的NH4+释放到原来的木质素降解体系中，提高了体系中氨的浓度，致使Mnp合成受到抑制[2]。3.2PcR5305、TvR4比Pc530在产锰过氧化物酶方面有更优良的性能在同一种谷氨酸浓度下，总体而言，杂色云芝TvR4比突变菌株PcR5305的酶活要高一些，两者又远高于野生菌株pc530。这表明，黄孢原毛平革菌突变菌株PcR5305、TvR4比野生菌株Pc530在产锰过氧化物酶方面有更优良的性能。有学者已经论证突变菌株PcR530无论在富氮（NS）还是限氮(LN)条件下，均比黄孢原毛平革菌pc530产生更多的NO且不受髙氮抑制，PcR530可能通过某种机制形成更高浓度的NO并因此启动富营养条件下WRF合成酶[12]。本实验的结果也一定程度上论证了其观点，在富氮培养条件下，无论哪种谷氨酸浓度，突变菌PcR530、TvR4的过氧化物酶（Mnp）酶活的最大值远远高于野生菌株的酶活。在开始产酶的时间上，突变菌株PcR5305、TvR4也比pc530的时间早，再第1天就有产酶，出现峰值的时间也比pc530的时间提前。在本实验中突变菌株丰富的氮源不仅使菌体快速生长，也使酶合成快速增加，这是菌株突变基因改变，使酶的合成已完全打破了营养特别是氮阻遏的现象，其具备了在初生代谢阶段合成锰过氧化酶的能力[13]。3.3谷氨酸对白腐菌的生长具有促进作用由上面分析可知谷氨酸对白腐菌生长具有促进作用，即谷氨酸浓度越高白腐菌生物量越大。微生物生长都要将糖类转化为蛋白质，糖类转化为蛋白质都需要经过中心氨代谢，而谷氨酸是中心氨代谢的必要物质[14]。谷氨酸浓度的增加可以加快糖类转化为蛋白质的速率，微生物长得就快。可以看出生物量曲线呈先上升后缓慢下降的趋势，应该与其生长曲线有关，典型的微生物生长曲线包括四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。开始刚接种，微生物对培养基不适应，其数量几乎不增长。刚开始白腐菌数量较少营养较为充沛，其数目增加很快。当营养开始紧缺时，白腐菌数又趋稳定，最后由于营养条件、微生物老化、代谢产物的抑制作用等白腐菌数逐渐下降。3.4锰过氧化物酶是白腐菌Pc530的次生代谢产物对于野生菌株Pc530来说，生物量达到最大值，即开始处于稳定期后酶的活性才快速增长，这种现象有学者证明了MnP属于次级代榭产物[15]，次级代谢产物是指生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质。它通常在微生物营养缺乏时才会产生，当营养缺乏时一般微生物达到稳定期，此时生物量会达到最大值。而其次生代谢产物锰过氧化物酶就较快的代谢，锰过氧化物酶的酶活增大可以降解木质素等难降解的物质为微生物提供能量。故与菌体生长不同步MnP的合成与菌体生长是非偶联[8]。4.小结通过实验可以得出，谷氨酸对白腐菌产锰过氧化物酶有完全抑制作用；黄孢原毛平革菌突变菌株PcR5305、TvR4比野生菌株Pc530在产锰过氧化物酶方面有更优良的性能；谷氨酸对白腐菌pc530的生长具有促进作用。而生物量与白腐菌产锰过氧化物酶没有直接必然的联系。控制好谷氨酸在白腐菌生长环境中的含量，可以提高白腐菌的产锰过氧化物酶的能力，对其在实际应用中，如生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污染物的降解和环境的生物修复等方面发挥重要作用。参考文献：[1]江凌、吴海珍，白腐菌降解木质素酶系的特征及其应用[J],化工进展，2007,26（2）:198-203.[2]李慧蓉,白腐真菌生物学和生物技术[M].北京:化学工业出版社，2005.[3]浦跃武、甄浩铭、冯书庭、梁世中，白腐菌产锰过氧化物酶条件的研究[J]菌物系统17(3):251-255.1998.[4]刘梦茹、付时雨，锰过氧化物酶应用的研究进展[J],林产化学与工业，2006,26(2):112-116.[5]吴香波、谢益民，白腐菌Coriolusversicolor的培养及产漆酶条件的研究[J],纤维素科学与技术,2009,17(2):12-19.[6]任大军、颜克亮，白腐菌在固体培养基下对吲哚和吡啶的降解[J]，环境污染与防治，2006,28（9）:658-661.[7]李华钟、章燕芳，黄袍原毛平革菌选择性合成木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶[J],过程工程学报,2002，2（2）:137-141.[8]杨晓宽，路福平，杜连祥,黄袍原毛平革菌产锰过氧化物酶培养基优化[J],生物计术,1004-311X（2004）03-0049-02.[9]StewartP,WhitwamRE,KerstenPJetal.Efficien