环状RNA hsa-circ-0000400在原发性结肠癌中的表达水平及其临床诊断意义

环状RNAhsa_circ_0000400在原发性结肠癌中的表达水平及其临床诊断意义摘要：目的：探讨结肠癌患者血清中环状RNAhsa_circ_0000400的表达水平及临床诊断意义，以及hsa_circ_0000400作为结肠癌诊断生物标志物的可行性。方法：培养结肠癌标准细胞株SW480,LOVO与正常人结肠粘膜上皮细胞株HCoEpiC，对常熟市第二人民医院收治的56份结肠癌患者肿瘤组织与相应癌旁组织，78份结肠癌患者血清与同期健康体检者血清进行分析。采用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测结肠癌标准细胞株SW480,LOVO与正常人结肠粘膜上皮细胞株HCoEpiC，结肠癌肿瘤组织及相应癌旁组织，及结肠癌患者与健康人血清hsa_circ_0000400相对表达水平，结合患者相关临床病理特征综合分析，如患者年龄、性别、临床分期、淋巴结转移现象等。用受试者工作特征曲线（ROC）评价hsa_circ_0000400对于结肠癌的诊断效能。成果：结肠癌标准细胞株LOVO，SW480中的hsa_circ_0000400相对表达量明显高于人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC，P值<0.05即意味着差异具有统计层面的意义。结肠癌患者肿瘤组织中hsa_circ_0000400的相对表达量升高，明显高于对应的癌旁组织（P值<0.05）。关于血清中hsa_circ_0000400的相对表达量，健康人分明要低于结肠癌患者（P<0.05）。hsa_circ_0000400表达与肿瘤TNM分期，分化程度及淋巴结的转移与否均有关（均P<0.05），均无关（均P>0.05）的是与患者的性别特征、年岁、肿瘤原发部位与大小等。单独使用hsa_circ_0000400作为诊断标志物时，0.888为ROC曲线下面积，临界值为4.185，敏感性与特异性分别为0.833、0.808。诊断标志物处于hsa_circ_0000400与CA19-9联合状态时，ROC曲线下面积由0.888扩大为0.945，敏感性与特异性分别为0.833、0.974。结论：hsa_circ_0000400可被作为一种新的结肠癌诊断生物学标志物，将其联合CA19-9一起进行检测，可进一步提升hsa_circ_0000400在结肠癌诊断中的作用。结肠癌（colorectalcancer,CRC）相对比较常见，为消化道恶性肿瘤，多发在乙状结肠与直肠交织位置，其发病率与死亡率仍处于逐年攀升状态。尽管结肠癌的临床诊疗技术取得了重大进展,但由于其早期症状不明显，依靠临床症状诊断并不能在第一时间发现肿瘤。而寻常的诊断方法如CT,MRI，X线，CEA,CA19-9等特异性较差，不能第一时间判断结肠癌的相关情况，因此有必要寻找一种新的生物学标志物，探索影响结肠癌进展的机制。环状RNA作为内源性非编码RNA，它具有特殊的环状结构，无5’端帽子和3’端poly(A)尾。circRNA极其稳定，能够经受住RNA酶的降解，是因其通过共价键形成的闭合环状构造。另外，在各异的物种中，circRNA具有非常高的保守性，其大量存在细胞质中，且在血液、唾液、外泌体中也能检测到丰富的circRNA，近年来越来越多的研究证实,circRNA与肿瘤的发生发展有关,并发挥着重要作用。circRNA能够作为相对理想地诊断疾病的生物标志物，主要是因为这种特性。本研究参考了目前已发表的circRNA，并结合circRNA数库circBase，选定了与结直肠癌相关的一种circRNA分子，即hsa_circ_0000400。旨在研究结肠癌组织、标准结肠癌肿瘤细胞株以及结肠癌病人血清中的表达情况与其对照组的表达差异，并验证其作用机制，探讨其成为新的结肠癌诊断生物学标志物的可行性。1.材料与方法1.1临床标本1.1.1组织标本：数据搜集时间为2016年1月至2019年12月；来源于常熟市第二人民医院普外科；对象为该科收治的56例结肠癌患者，其中所有患者还具有没有经过化疗、放疗或靶向药物治疗的特征。对于标本采取的原则则是对每一例不仅取癌组织，还采取癌旁的正常组织（距离癌组织3厘米），组织标本取出后用TRIzol浸泡后立即放入-80℃冰箱保存。患者病理切片均经常熟市第二人民医院病理科专家诊断为结肠癌，有完整的临床病理记录。56例病例中，男31例，女25例；年龄小于60岁21例，大于等于60岁35例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期42例；高、中分化41例，低分化15例。在采取研究的所有患者标本前，均已签署患者知情同意书。1.1.2血液标本：采取时间为2018年1月至2020年10月；来源单位是常熟市第二人民医院普外科；标本对象为该科收治的结肠癌患者；一共78例，其中男女比例分别为42与36例，年龄上小于60岁的32例，大于等于60岁46例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期53例；高、中分化52例，低分化26例。操作标准是于手术前天早晨采血，容量为5ml，前提条件是采样对象一律没经过任何治疗。对照组标本随机选取自2020年9月在常熟市古里中心卫生院参加健康体检的人群。血液样本的储存与提取方法则是在肝素抗凝管中采用TRIzol法提取血样中总RNA。1.2细胞株及细胞培养胞株来源是于浙江如耀生物科技有限公司采购，包括人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC、结肠癌SW480与LOVO标准细胞株。细胞的常规培养则是在RPMI1640（含10%胎牛血清）培养基中。1.3主要试剂仪器通过采购获取主要试剂仪器，上海新贝生物科技有限公司：hsa_circ_0000400和Human/Mouse18S；南京诺唯赞生物科技股份有限公司：HiScriptIIReverseTranscriptase逆转录试剂盒和SYBRGreenPCR试剂盒；美国Thermo公司：Trizol试剂、NanoDrop1000分光光度计；美国ABI公司：7500荧光定量PCR仪；CL-6000i全自动化学发光免疫分析仪购自深圳迈瑞公司。1.4RNA提取和QPCR对于样本的总RNA，经Trizol法提炼测定，其纯度与浓度以NanoDrop1000分光光度计测定，RNA标本标准为260nm/280nm处吸光度值为1.8～2.0，用HiScriptIIReverseTranscriptase逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录合成cDNA。反应体系为20μL，反应条件：42℃3min，60℃15min，85℃5min。以cDNA为模板，SYBRGreenPCR试剂盒检测表达水平。反应体系为10μL，反应条件：95℃预变性5min，95℃10S，60℃30S，共40个循环。以Human/Mouse18S为内参，以2-ΔΔCt表示相对表达量。hsa_circ_0000400F：ACTTACCTCGACTCTTAGCTTGTCG，R：GGTCTTGTCACTTGGCATCTGG，Human/Mouse18SF：GAACGAGACTCTGGCATGCTA，R：CACGCTGAGCCAGTCAGTGTA1.6血清CA19-9检测血清CA19-9的检测需要采用迈瑞CL-6000i全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂。1.7统计学分析利用统计软件分析研究，此处选用SPSS23.0。对于全部采集数据都使用均数±标准差的标识，组与组之间的比较通过t检验实现。采用受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲线评价hsa_circ_0000400的诊断效能。P值＜0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1hsa_circ_0000400在结肠癌标准细胞株SW480,LOVO及人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC中的表达比较经过QPCR检测，结果表明（图1），在结肠癌标准细胞株SW480，LOVO，以及人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC中，hsa_circ_0000400的相对表达量分别为315.52±23.53,95.04±12.06和0.81±0.25，在关于结肠癌标准细胞株中hsa_circ_0000400表达高于人正常结肠上皮细胞株（P＜0.05）。2.2hsa_circ_0000400于结肠癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达比较经过QPCR检测，结果表明（图2），在56例结肠癌患者的肿瘤组织以及癌旁正常组织中的hsa_circ_0000400相对表达量分别为10.19±4.00和4.42±1.66，hsa_circ_0000400在结肠癌肿瘤组织中的表达高于癌旁正常组织（P＜0.05）。2.3hsa_circ_0000400在结肠癌患者血清及健康人血清中的表达比较QPCR检测结果显示（图3），分别对比两种血清中hsa_circ_0000400的相对表达水平，即结肠癌患者血清及健康人血清，分别为7.34±3.40和2.62±1.09。hsa_circ_0000400在结肠癌患者血清中的表达高于健康人（P<0.05）。图1hsa_circ_0000400在结肠癌标准细胞株SW480,LOVO及人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC中的表达情况图2hsa_circ_0000400在结肠癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达情况图3hsa_circ_0000400在结肠癌患者血清及健康人血清中的表达情况2.4结肠癌患者肿瘤组织中hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系结肠癌患者肿瘤组织中hsa_circ_0000400表达水平与TNM分期，分化程度及淋巴结转移均有关（均P<0.05），而与患者性别特征、年岁、原发部位、肿瘤大小等均无关（均P>0.05），见表1。2.5结肠癌患者血清hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系结肠癌患者血清hsa_circ_0000400表达水平与TNM分期，分化程度及淋巴结转移均有关（均P<0.05），而与患者性别特征、年岁、原发部位、肿瘤大小等均无关（均P>0.05），见表2。表1：56例结肠癌患者组织hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系(x±S)表2：78例结肠癌患者血清hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系(x±S)2.5血清hsa_circ_0000400的相对表达量对结肠癌的诊断效能ROC曲线分析，单独使用hsa_circ_0000400作为结肠癌患者和健康人的诊断指标时，4.185为临界值，0.888的曲线下面积（areaundercurve,AUC），敏感性与特异性分别为0.833，0.808。若联合CA19-9联合诊断，ROC曲线下面积增加至0.945，敏感性0.833，特异性0.974。见图4图4hsa_circ_0000400的ROC曲线以及hsa_circ_0000400联合CA19-9的ROC曲线3讨论虽然近年来关于结肠癌的临床治疗有了长足进步，但是其发病率仍年复一年攀升。但由于其初期症状不明显，且现有常规检测方法敏感度较低，许多患者在发现时已有转移。于此，寻找一种新型生物学标志物，提高结肠癌的初期诊断率，是当前结肠癌研究中迫切需要解决的重大问题。circRNA是一种新型的RNA分子，表现为首尾相连的环状结构，其主要经反式剪接使5’端帽子和3’端poly(A)尾通过共价键形成。circRNA构成十分稳定，并且大量存在于细胞质中，且在血液、唾液、外泌体中也能被检测到。目前认为circRNA主要作为“miRNA海绵”，其主要经过竞争性结合miRNA，从而能够参与到肿瘤出现演变进程。已有研究发现，circRNA与癌症的产生，发展、转移等紧密相关，在癌症中异常表达。LiBo等研究发现，circRNABCRC4通过调节microRNA-101从而抑制ECH2在RNA和蛋白水平上的表达，能够启发膀胱癌的鉴定与治疗，为其提供一条新思维路径。ChiHinWong等研究发现，circFOXK2在胰腺导管腺癌患者中明显上调，通过与YBX1和hnRNPK复合可以促进胰腺导管腺癌的发展。Zheng等研究表明在三阴性乳腺癌组织中circSEPT9表达增高，且与临床进展及不良预后呈正相关。本研究结果显示，通过实时荧光定量PCR法检测结肠癌组织、结肠癌标准细胞株以及结肠癌患者血液hsa_circ_0000400相对表达量均明显高于其对照组，结果有统计学意义（P<0.05），提示hsa_circ_0000400可能作为促癌基因发挥作用，表现为对于结肠癌的产生发展与转移起到促进作用，且与患者TNM分期、肿瘤分化程度、以及淋巴是否转移有关，而与患者的性别特征、年岁与肿瘤部位等无关。所以，检测患者血液hsa_circ_0000400表达量有望成为结肠癌诊断和预后评估的新型生物学标志物。现如今，CA19-9已被用于临床结肠癌的诊断，但是长链非编码RNA与其相比更具优势，在以往的一系列研究中，LiNA研究发现，CircTNL1XR1调节控制结肠癌发展的路径是靶向调控miR-424/Smad7通路。胡洪林等研究发现，LncRNARP5-1185K9.17高表达的患者的总生存时间及中位生存时间均较低表达者明显缩短，影响结肠癌患者预后不佳的因素是LncRNARP5-1185K9.17。陈澄亮等研究发现，在结肠癌患者组织中紧密相关联的是高表达量的circ_001947和ADAM19mRNA与患者淋巴结转移和病理分期。为了提高结肠癌在早