微生物大小及数量的测定

微生物大小及数量的测定微生物大小及数量的测定摘要：本实验主要学习并掌握显微测微尺测定微生物大小的方法和如何使用血细胞计数板计量微生物细胞数量。关键词：显微测微尺显微计数法血细胞计数板前言（一）微生物大小的测定微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺（图1）是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格，每格长度等于0．01mm（即106μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是专用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺（图1）是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同。因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小。在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。图1测微尺及其安装和校正（二）微生物数量的测定显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图2。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）。图2血细胞计数板构造示意图1材料1.1菌种酿酒酵母，枯草芽孢杆菌。1.2溶液和试剂碱性美蓝染液,香柏油，二甲苯。1.3仪器和其他用品目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，血细胞计数板，计数器，载玻片，盖玻片，擦镜纸，接种环，酒精灯，毛细滴管，试管等。2实验步骤2.1微生物大小的测定2.1.1目镜测微尺的安装取出接目镜，把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放入目镜的隔板上．然后旋上目镜透镜，再将目镜插回镜筒内(见图1)。2.1.2校正目镜测微尺将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，并将刻度对准视野中央。先用低倍镜观察，对准焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行。利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，记录两次重叠刻度间目镜测微尺与镜台测微尺的格数（图1）。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。按下列公式分别计算出不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（μm）=2.1.3菌体大小测定将镜台测微尺取下，分别换上枯草芽孢杆菌染色装片及酵母菌涂片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量枯草芽孢杆菌和酵母菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出菌体宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。2.1.4测定完毕测量完毕后取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。2.2显微计数法2.2.1菌悬液的稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释。2.2.2检查血细胞计数板在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。2.2.3加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。加样后静置5分钟，时细胞或孢子自然沉降。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。2.2.4显微镜计数将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。2.2.5清洗使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，放回盒中。3实验结果3.1微生物大小的测定3.1.1校正目镜测微尺目镜测微尺校正结果物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度/μm低倍镜1091011.111高倍镜402052.500油镜1004910.204注：目镜放大倍数为10倍。3.1.2各菌测定记录菌种酿酒酵母枯草芽孢杆菌长度1112131087宽度988111注：目镜放大倍数为10倍，物镜放大倍数为100倍。3.1.3各菌测定计算结果细菌名称目镜测微尺每格代表的长度/μm宽长菌体大小/μm2目镜测微尺平均格数宽度/μm目镜测微尺平均格数长度/μm枯草芽孢杆菌0.20410.208.31.690.34酿酒酵母0.2048.31.69122.454.143.2显微镜计数结果稀释倍数各中格菌数5个中格总菌数A1ml菌液中菌数12345酿酒酵母1056686063553021.51×1083.3结果分析在测量细菌大小的实验中，菌体的大小随菌龄和环境条件而异,或读数不准确均会造成误差。在显微镜计数的实验中，对菌液稀释时稀释倍数的不准确把握和实验的重复次数较少都会影响实验结果。3.4思考题3.4.1在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时其结果不相同，因为物镜放大倍数不同，使得目镜测微尺每格代表的数值不同，精确度不一样，因此数值不同。3.4.2血细胞计数板计数时的误差来源：计数室内有气泡将影响菌悬液随机分布而使计数产生误差，并且改变了菌悬液的总浓度；重复计数；遇到有出芽的酵母菌计为两个。4小结使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻度