植物生理实验报告

本科学生综合性实验报告

项目组长高铭远

学号07070241011成员杜广宇、杜沙沙、段司宇、冯慧彬、宫亚坡专

业生物技术

班级

1班

实验项目名称小麦耐盐生理指标测定指导教师及职称尉连伶

讲师开课学期

2008

至

2009学年2学期上课时间

2009年

4

月

22

日植物耐盐性生理指标的测定一、实验目的及要求通过本实验的学习，使学生掌握脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量测定方法，掌握单因子方差分析，培养学生离心机和分光光度计的使用技能，为今后撰写毕业论文打下良好的基础。二、实验主要仪器和试剂仪器:离心机；分光光度计；恒温水浴锅试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3％磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10％TCA；0.6％TBA三、实验原理植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势,维持植物体内的水分平衡,保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。四、实验步骤（一）实验材料的培养小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培（二）盐胁迫处理用100mmol/LNaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。（三）脯氨酸含量测定1.标准曲线的制作用100μg/ml脯氨酸配制成2、4、6、8、10μg/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3%磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5%茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。2.脯氨酸的提取称取小麦叶片0.53.反应体系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm处测得A值。4.脯氨酸的含量的计算从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（μg/g）。（四）过氧化物酶活性的测定1.过氧化物酶的提取称取小麦叶片0.2g，加5mlpH6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02gPVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4℃，5000rpm离心152.反应体系50μl酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔1min记一次数值，连续记录三次，取平均值。3.酶活力定义过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/min·g（五）丙二醛含量测定1.丙二醛提取小麦叶片0.5g，加入10﹪三氯乙酸(TCA)5mL(分两次加)和少量石英砂充分研磨，匀浆液以5000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。2.反应体系取2mL提取液，分别加入2mL0.6﹪TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm下的A值。以2mL水代替提取液调零。3.MDA含量计算：根据C＝6.45×A532－0.56×A450，计算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计算出每克样品中丙二醛的含量(μmol/g（FW)。五、实验结果标准液浓度（ug/ml）00.40.81.21.62.0A值00.0210.0470.0650.0850.102原始数据：对照处理A值含量或活性（FW）A值含量或活性（FW）脯氨酸含量1.0.0472.0.0513.0.0531.109.67192.119.35283.124.19331.0.1172.0.1873.0.3061.279.08752.448.50303.736.5095POD活性1.A值0.448，0.569，0.684，0.786差值0.121，0.115，0.1022.A值0.541，0.717，0.875，1.021差值0.176，0.158，0.1463.A值0.701，0.880，1.046，1.196差值0.179，0.166，0.1501.11266.672.160003.165001.A值0.877，1.112，1.322，1.511差值0.235，0.210，0.1892.A值1.112，1.389，1.622，1.807差值0.277，0.233，0.1853.A值1.139，1.434，1.676，1.869差值0.295，0.242，0.1931.21133.332.23166.673.24333.33丙二醛含量1.A450=0.408A532=0.1962.A450=0.397A532=0.1993.A450=0.443A532=0.2051.51.7862.53.06153.53.70851.A450=0.544A532=0.2022.A450=0.447A532=0.2013.A450=0.504A532=0.1861.49.9132.52.30653.45.873单因子方差分析结果：对照处理脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259bPOD活性14588.89±2887.97a22877.78±1619.443b丙二醛含量52.852±0.978222a49.36417±3.251676a六、结果分析本次实验所得结果中，脯氨酸含量和POD活性测得结果差异显著，但丙二醛含量所测结果对照组与盐处理组差异并不十分明显，综合分析有以下原因：①由于本次实验时间较长，前后相差一个月左右，致使三次测定中实验材料存在差异。②麦苗所取部位不同，如叶部和茎部中脯氨酸含量、POD活性和丙二醛含量存在的差异可能影响实验结果。③试验中，研磨不充分、石英砂和PVP加入不适量、每次水浴加热时间控制不精确等，都可能影响分光光度计测得结果，从而影响实验结果。④由于测定丙二醛含量是，由多人测量，可能存在的误差较大，导致丙二醛含量两组差异不显著。⑤实验中存在一系列的机械误差，也可能是影响实验结果。七、思考题：1.为什么使用砂培法培养实验材料？①沙培介质的通气性较好，可以保证根际有较好的通气性。②沙子的粒径较小,持水量较多,扩散范围大,根系能充分吸水吸肥，且根系水平方向伸展。③每次都用新鲜营养液，较好的维持养分平衡，减少调控营养液的麻烦。④持水量大，工业次数可减少，每天供液1—2次即可。⑤水和肥料的用量较多，吸收利用率也不高，易于产生盐类积累。⑥虽不易较精确控制，但仍可以调节PH。2.分光光度法要求A值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？在实际分析工作中，溶液的吸光度控制在0.2～