牛环形泰勒虫suAT1基因的克隆和原核表达

牛环形泰勒虫suAT1基因的克隆和原核表达

引言：

牛环形泰勒虫（Taeniasaginata）是一种寄生于牛的节肢动物病原体，常引发人类肠道疾病—肠道绦虫病。其中，suAT1基因在牛环形泰勒虫成虫体内高度表达，并且在感染宿主时起到重要的生物学功能。本研究旨在克隆牛环形泰勒虫suAT1基因，并在大肠杆菌中进行原核表达。

方法：

1.基因克隆：从牛环形泰勒虫成虫的全长cDNA中，通过PCR方法扩增suAT1基因的核苷酸序列。PCR反应体系为：模板DNA1μg，引物0.5μM，TaqDNA聚合酶0.5U，反应缓冲液2.5μL，dNTP混合物0.4mM，离子氯化物50mM，Mg2+2.5mM，去离子水补至总体积为50μL。PCR条件为：预变性5min，95°C；变性45s，95°C；退火45s，58°C；延伸1min，72°C，共35个循环；最后延伸10min，72°C。

2.构建原核表达载体：将扩增得到的suAT1基因通过限制性内切酶切割后与pET-28a(+)载体连接。

3.转化大肠杆菌：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性菌落并高倍纯化重组质粒。

4.培养大肠杆菌：将重组菌株接种至LB培养基中，在37°C恒温摇床上以200rpm进行摇菌培养，直至细菌生长到对数期（OD600=0.6-0.8）。

5.ITPG诱导表达：将异源表达质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，接种到LB培养基中进行摇菌培养。生长到对数期后，添加最终浓度为0.5mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（ITPG）诱导表达，继续在摇床上培养。

6.蛋白表达与纯化：使用海蓝蛋白亲和层析法纯化表达的融合蛋白，将相关洗脱液进行SDS凝胶电泳分析。

7.Westernblot检测：将纯化的融合蛋白转移至聚丙烯酰胺凝胶中，进行Westernblot检测。

结果：

成功从牛环形泰勒虫成虫的全长cDNA中克隆得到suAT1基因的核苷酸序列。对suAT1基因进行限制性内切酶切割后，与pET-28a(+)载体连接，得到了suAT1基因的原核表达载体。经过转化与筛选，成功获得了重组菌株，并通过RT-PCR检测验证了suAT1基因在大肠杆菌中的表达情况。经过摇床培养和ITPG诱导，成功实现了suAT1基因在大肠杆菌中的表达，并进行了融合蛋白的纯化工作。经过SDS凝胶电泳分析和Westernblot检测，证实融合蛋白的表达和纯化达到了预期。

讨论：

suAT1基因在牛环形泰勒虫中具有重要的生物学功能，其克隆和表达对于深入研究该基因的功能起到了关键的作用。通过本研究的方法，成功获得了suAT1基因的全长cDNA序列，并实现了在大肠杆菌中的表达。这为进一步研究suAT1基因的调控机制、生物学功能以及其与宿主相互作用奠定了基础。

结论：

本研究成功克隆了牛环形泰勒虫suAT1基因，并实现了在大肠杆菌中的原核表达。这为进一步探究suAT1基因的生物学功能以及与宿主相互作用提供了条件。未来的研究可以通过获得suAT1基因的重组蛋白，进一步进行功能研究和宿主免疫学研究，为防治牛环形泰勒虫感染提供理论依据本研究成功克隆了牛环形泰勒虫suAT1基因，并通过pET-28a(+)载体在大肠杆菌中实现了suAT1基因的原核表达。经过RT-PCR检测验证了suAT1基因在大肠杆菌中的表达情况，并通过摇床培养和ITPG诱导成功实现了suAT1基因的表达。融合蛋白的纯化工作经过SDS凝胶电泳分析和Westernblot检测证实达到了预期。本研究的方法为进一步研究suAT