双水相体系是怎样形成的其分配机理是什么什么双水相

双水相体系是怎样形成的？其分配机理是什么？什么双水相萃取？双水相体系的相图？双水相萃取的原理是什么？特点是什么？影响双水相萃取体系的因素有哪些？其应用范围是什么？2.3双水相萃取2.3.1双水相体系的形

成与分配2.3.2双水相萃取分离的原理2.3.3双水相萃取体系的影响因素2.3.4双水相萃取操作及特点2.3.5双水相萃取的应用

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重点：

难点：本节要点及学习要求双水相体系的形成与分配机理双水相萃取分离的原理双水相体系中的分配平衡：静电作用、疏水作用。聚合物的不相溶性、系线、双节线、临界点。影响物质分配平衡的因素：

双水相中聚合物组成的影响；双水相系统物理化学性质的影响；盐和缓冲液的影响；温度的影响。双水相系统的应用。双水相体系的形成与分配机理，双水相萃取分离的原理和特点。双水相体系的形成与分配机理。双水相萃取技术(two-aqueousphaseextraction,ATPS)又称水溶液两相分配技术(1)概述：

基因工程产品如蛋白质和酶的特点:

传统的溶剂萃取法并不适合。反胶束的办法可克服这些问题，但存在大量使用有机相和相的分离问题。基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。2.3.1双水相体系的形成与分配活性和功能对pH值、温度和离子强度等特别敏感；在有机溶剂中的溶解度低并且会变性。技术诞生1896年Beijerinck观察到

先得到一浑浊不透明溶液，随后分为两相,水相也可以分为两相，即双水相系统?将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一个水相中__双水相萃取.开始于本世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激素、病毒等分离提纯。近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。明胶-琼脂水溶液混合明胶-淀粉水溶液混合2.3.1双水相体系的形成与分配(2)双水相体系双水相在一定浓度范围密度不同两相两相均含有较多的水明胶-琼脂水溶液混合明胶-淀粉水溶液混合葡聚糖-甲基纤维素亲水性高分子聚合物水水溶液2.3.1双水相体系的形成与分配向水相中加入高分子化合物PEG/葡聚糖或盐，在一定组成范围内，可以形成密度不同的两相。轻相富含高分子化合物PEG，重相富含盐或高分子化合物Dx葡聚糖。举例2.3.1双水相体系的形成与分配葡聚糖-甲基纤维素钠两相体系2.3.1双水相体系的形成与分配0.39%葡聚糖0.65%甲基纤维素钠98.96%水1.58%葡聚糖0.15%甲基纤维素钠98.27%水聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羟丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇、Dex硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基甲基纤钠盐聚乙二醇磷酸钾、硫酸铵硫酸钠、硫酸镁

几种典型的双水相系统2.3.1双水相体系的形成与分配各种双水相体系2.3.1双水相体系的形成与分配聚合物1聚合物2或盐聚合物1聚合物2或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇乙基羟乙基纤维素葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇羟丙基葡聚糖葡聚糖聚乙烯吡咯烷酮羟丙基葡聚糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇聚丙二醇甲氧基聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮磷酸钾聚乙烯吡咯烷酮葡聚糖聚蔗糖聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮甲基纤维素聚乙二醇硫酸镁硫酸铵硫酸钠甲酸钠酒石酸钾钠羟丙基葡聚糖葡聚糖甲基纤维素羟丙基葡聚糖葡聚糖(3)双水相体系的类型双聚合物体系常用PEG/Dx聚合物与无机盐体系

如PEG/磷酸钾表面活性剂-表面活性剂亲和配基-高聚物,亲和双水相萃取2.3.1双水相体系的形成与分配双聚合物体系聚合物/盐体系活性损失小大盐浓度低高成本高低粘度大小环境污染无废水处理困难其它分相困难界面吸附多比较2.3.1双水相体系的形成与分配4.聚合物双水相形成机理两个因素体系熵的增加单一相富含不同聚合物的两相聚合物的不相容性一定浓度范围空间位阻,相互排斥双相两种聚合物相互混合分离混合分相2.3.1双水相体系的形成与分配(5)双水相萃取分离的原理生物分子在双水相体系中的选择性分配分配规律服从能特特分配定律.与溶剂萃取比,表现出更大或更小的分配系数.→相图2.3.1双水相体系的形成与分配双水相体系的相图a系线双节线均相区两相区临界点TB2.3.1双水相体系的形成与分配K临界点TKB双节线双水相体系的相图•N节线M’B’T’单相双相2.3.1双水相体系的形成与分配M点,两相T和B的量之间的关系(体积)服从杠杆规则，即

系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(criticalpoint)。2.3.1双水相体系的形成与分配2.3.2.1双水相分配系数分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用。包括：静电作用疏水作用生物亲和作用。分配系数是各种相互作用力的和。

lnm=lnme+lnmh+lnml2.3.2双水相萃取体系的影响因素2.3.2.2影响分配系数的因素分析1）成相聚合物

---相对分子质量和浓度影响分配平衡.对于成相聚合物系统和生物大分子来说：A聚合物的分子量降低上相分子量降低下相分子量降低生物大分子该相溶解度增大形成双水相所需的浓度越高分配系数增大分配系数降低B成相聚合物的浓度越高两相体系距离临界越远分配系数增大。2.3.2双水相萃取体系的影响因素2）盐的种类和浓度---主要影响相间电位和蛋白质疏水性。在双聚合物双水相系统中无机离子分配系数相间电位不同影响带电蛋白质、核酸生物大分子的分配系数盐种类2.3.2双水相萃取体系的影响因素影响蛋白质的表面疏水性，改变各相成相物质组成和相体积比.分配系数随盐浓度增加而增加,不同蛋白质增加不同.盐浓度调节双水相系统的盐浓度，可有效萃取分离不同的蛋白质PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。2.3.2双水相萃取体系的影响因素3）pH值4）温度温度影响相图,规模化操作采用常温,一般双水相系统来说，温度的影响很小。蛋白质的表面电荷数磷酸盐的解离改变影响pH值分配系数系统的相间电位和蛋白质的分配系数。影响改变2.3.2双水相萃取体系的影响因素2.3.2双水相萃取体系的影响因素温度的影响温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性；(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离；(3)常温操作节省冷却费用。2.3.2双水相萃取体系的影响因素6)双水相体系物理化学性质的影响：

双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：

密度(ρ)和两相间的密度差黏度(μ)和两相间的黏度差以及表面张力(σ)相间电势差,相分离时间等。5)低分子量化合物:高浓度时起作用。2.3.2双水相萃取体系的影响因素系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是1。界面张力增加→系线的长度增加,上相和下相相对组成的差别就增大，这将会极大地影响产物如酶分配系数，使酶富集于上相。2.3.2双水相萃取体系的影响因素2.3.3.1双水相系统的选择选择原则：根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别综合利用静电作用、疏水作用,添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。2.3.3双水相萃取操作及特点目标产物与杂蛋白的等电点不同，调节系统pH值，添加适当盐，产生希望的相间电位。目标产物与杂蛋白的疏水性不同－充分利用盐析作用增大成相系统浓度－使细胞碎片选择性分配于下相。采用相对分子质量较大的PEG降低蛋白质的分配系数，提高目标蛋白的选择性。方法2.3.3双水相萃取操作及特点2.3.3.2双水相萃取过程包括：双水相的形成溶质在双水相中的分配双水相的分离。2.3.3双水相萃取操作及特点萃取一般操作蛋白质在两相中发生物质传递，达到分配平衡；采用离心沉降进行相分离。固体聚合物盐细胞匀浆加入搅拌成相物质溶解形成双水相2.3.3双水相萃取操作及特点图5-19聚已二醇(PEG)-磷酸盐双水相体系萃取酶的一般流程2.3.3双水相萃取操作及特点两步萃取法连续分离胞内酶的流程图2.3.3双水相萃取操作及特点2.3.3.3双水相萃取的特点：相混合能耗低，达到萃取平衡所需的时间短易进行工业放大(10ml离心管的实验结果即可放大）适于易失活的蛋白质的提取纯化（超滤或沉淀）易实现连续操作－最大特点蛋白质下游加工中比较独特2.3.3双水相萃取操作及特点可用于多种生物活性物质的分离纯化1）酶的提取和纯化酶主要分配在上相，菌体在下相或界面处.2.3.4双水相萃取的应用表5-7双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例p842.3.4双水相萃取的应用2）核酸分离纯化用PEG/Dextran体系萃取核酸时，盐组分的微小变化将会引起分配系数的微小变化。3）人生长激素的提取用PEG40006.6%/磷酸盐14％体系从E.coli碎片中提取人生长激素（hGH)（hGH)分配在上相，分配系数6.4，收率60％.2.3.4双水相萃取的应用从E.coli中提取hGH的三级错流萃取收率为81％2.3.4双水相萃取的应用4）β干扰素（β-IFN)的提取不用PEG/Dextran体系用PEG－磷酸酯/盐的体系才能使β-IFN分配在上相，杂蛋白分配在下相。层析技术双水相萃取结合双水相萃取，层析纯化工业生产2.3.4双水相萃取的应用5）病毒的分离纯化6）生物活性物质的分析检测