高二生物同步讲义：基因工程的基本操作程序（学生版）

《第3章基因工程》第2节基因工程的基本操作程序必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一目的基因的筛选与获取1．目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。2．获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。②基因文库的种类：基因组文库：包含一种生物所有的基因；部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。cDNA文库与基因组文库的区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因数量某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以③从基因文库中获取目的基因的方法：用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因。根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。基因文库中变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合成杂交链，这一片段即含有所需的目的基因。(2)利用PCR获得和扩增目的基因①含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。需要具备的条件有模板、原料、引物、酶、控制温度等。②原理：利用DNA半保留复制原理，在体外将目的基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量成指数形式扩增(约为2n，其中为扩增循环的次数)。③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。④PCR的反应及其作用条件作用在一定的缓冲液(含Mg2+)中进行提供相对稳定的pH环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料DNA母链作为DNA复制的模板Taq酶(耐高温)催化合成DNA子链引物使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸温度控制90℃以上变性：使DNA片段双链解开50℃左右复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合(退火)72℃左右延伸：Taq酶催化子链合成⑤扩增的过程：第一步：将反应体系(包括双链模板、引物、Taq酶、4种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热至90℃以上，使双链DNA两条链之间的氢键打开，变成单链，分别作为聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至50℃左右，使引物分别与模板DNA链3'端的相应序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至72℃左右，在Taq酶的催化作用下，将与模板DNA互补的单个核苷酸加到引物所提供的3'—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的单链DNA。如图所示：上述三步反应完成后，一个DNA片段就变成了两个DNA片段，随着重复次数的增多，DNA的数量就以约2n的倍数增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪(PCR仪)中完成的。完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。必会知识二基因表达载体的构建1．基因表达载体的构建是基因工程的核心。其中心内容是使目的基因与运载体结合，形成重组运载体，最后通过重组运载体将目的基因导入受体细胞。2．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。3．基因表达载体的组成及其作用(1)目的基因：外源DNA分子中有遗传效应的片段。(2)启动子：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。(3)终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录结束点。(4)标记基因的作用：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。3．基因表达载体的构建过程(1)用一定的限制酶切割载体，使其出现一个黏性末端(或平末端)的切口。(2)用限制酶切割目的基因，产生与载体一样的黏性末端(或平末端)。(3)将切下的目的基因片段与载体混合，再加入适量DNA连接酶，使载体与目的基因结合成重组DNA分子(如图)。必会知识三将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞的基因组中，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞。2．将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的导入方法也不同，见下表。细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术Ca2+处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。操作过程：将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养后移入母体子宫或输卵管→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞感受态细胞→将重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收外源DNA分子必会知识四目的基因的检测与鉴定1．检测目的：目的基因导入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。2．检测对象(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。3．检测方法类型检测内容方法结果显示分子水平检测目的基因是否插到受体细胞的DNA上从转基因生物中提取DNA，用标记的目的基因作探针，进行DNA分子杂交如果显示出杂交带，表明日的基因已插入染色体DNA上目的基因是否转录出mRNA从转基因生物中提取mRNA，进行分子杂交(DNA和mRNA之间杂交)如果显示出杂交带，表明转录成功目的基因是否翻译成蛋白质从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交如有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品个体水平鉴定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同转基因生物的抗性接种实验：比较基因工程产品与天然产品的功能活性是否赋予了预期抗性或蛋白质活性必会知识五DNA片段的扩增及电泳鉴定1．实验原理(1)DNA片段的扩增①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。(2)DNA片段的电泳鉴定①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。2．材料用具(1)仪器：PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)(2)用具：4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。3．方法步骤(1)DNA片段的扩增(2)DNA片段的电泳鉴定必备技能典例精讲模型秒杀巧思妙解必备技能一获取目的基因的方法[例1](2022春·陕西西安·高二校考期末)下列不属于获取目的基因的方法是(

)A．利用mRNA反转录形成 B．从基因组文库中提取C．从受体细胞中提取 D．利用化学方法人工合成必备技能二PCR技术的原理、过程及条件[例2](2023·全国·高三专题练习)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(

)A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16必备技能三基因表达载体的构建[例3](2023·浙江·统考一模)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，下列相关叙述正确的是(

)A．其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列出现了错误B．据图甲分析其中翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P可能不同C．运用限制性核酸内切酶EcoRⅠ切割启动子可以识别P基因的序列D．通过PCR技术一定程度上可以解决融合基因出现排斥的反应必备技能四目的基因导入受体细胞的方法[例4](2022秋·江苏淮安·高三校联考期中)在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。下图为花粉管通道法的一般原理示意图。相关叙述正确的是(

)A．外源DNA进入胚囊最终获得的种子均含有目的基因B．植物生长各个时期均可通过花粉管通道导入外源DNAC．花粉管通道法最大的优点是无需植物组培，技术简单D．含外源DNA的种子发育成植株后均具有相应性状必备技能五目的基因的检测与表达[例5](2022春·陕西渭南·高二统考期末)下列选项中能说明目的基因已成功导入受体细胞中并表达的是(

)A．在棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．在大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．在山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．在酵母菌细胞中提取到人干扰素必备技能六基因工程操作步骤的综合考查[例6](2022·浙江·模拟预测)如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是(

)A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活B．过程②用Ca2＋处理使农杆菌细胞壁的通透性改变，成为感受态细胞C．检测是否转化成功，过程③应在培养基中加入除草剂和物质KD．转化过程中未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长是因为基因漂移必刷好题基础演练能力提升巅峰突破1．(2022秋·安徽·高三校联考阶段练习)体外条件下，DNA复制必须有引物，引物是一小段单链DNA或RNA，引物的3ʹ端为结合模板DNA的关键碱基，5ʹ端无严格限制，可添加某些序列。下列有关叙述正确的是(

)A．引物制备的前提是已知目的基因的全部脱氧核苷酸序列B．引物可以作为DNA复制开始时RNA聚合酶的结合位点C．进行体外DNA复制时，引物设计要有两种且不能互补配对D．PCR时，dNTP作为扩增的原料会依次连接到引物的5ʹ端2．(2022·浙江·统考模拟预测)反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是(

)A．I酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端B．II连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键C．设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’”D．对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”3．(2022春·辽宁丹东·高二统考期末)重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理见图。下列说法错误的是(

)A．过程②需要含Mg2+的缓冲液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C．经过过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过过程⑤获得目的基因D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物4．(2022春·河北石家庄·高二统考期末)RT-PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的PCR相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。以下说法错误的是(

)A．设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列B．GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度C．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等D．过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n-1个引物B5．(2020秋·天津·高二校联考期末)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，以下相关叙述，正确的是(

)A．用Ti质粒作为基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，①、②的操作中使用了限制酶和DNA聚合酶B．应用DNA探针技术，可检测④细胞中目的基因是否表达C．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用CaCl2处理细菌以增加细胞壁的通透性D．用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染正在组织培养中的单子叶植物细胞，再将被感染后的细胞培养成植株，就可能获得具有抗旱基因的植物6．(2022春·山东德州·高二德州市第一中学校考周测)下图表示运用影印培养法(使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)，检测重组质粒是否导入大肠杆菌。下列相关叙述错误的是(

)A．导入大肠杆菌的重组质粒中有特殊的标记基因B．影印培养法使用的是固体培养基进行微生物培养C．培养基A和B中的1菌落的类型并不相同D．培养基A和培养基B的化学成分不完全相同7．(2022秋·黑龙江大庆·高三铁人中学校考开学考试)我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵，培育出转基因鲤鱼，与对照组相比，生长速度加快。科学家介绍，外源基因导入受体细胞后，必须整合到受体细胞的DNA上才能发挥作用。下列有关说法错误的是(

)A．导入的是DNA分子的一段脱氧核苷酸序列B．将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法C．未整合到受体细胞DNA上的生长激素基因也不会被DNA酶水解D．外源基因能整合到其它生物的DNA上是因为它们的结构与组成相类似8．(2022秋·浙江绍兴·高三校考阶段练习)某转基因植物培育过程如下图所示。下列叙述错误的是(

)A．重组Ti质粒的浓度和质量会影响其导入农杆菌的效率B．与机械法相比，酶解法获得单细胞的效率更高C．农杆菌的浓度和状态会影响目的基因导入植物细胞的效率D．前置筛选和后置筛选所依据的指标是相同的9．(2022秋·浙江杭州·高三浙江省杭州第二中学校考阶段练习)常见的探针有核酸探针和蛋白质探针。两种探针结构和功能均不相同，故而应用在不同的检测中。而两种探针的制备过程中所应用的技术也不相同。请回答下列问题。Ⅰ、蛋白质探针的制备。(1)蛋白质探针常用_____________技术来制备。该技术的基本流程是将_____________注射给实验动物，获取的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，用HAT培养基筛选培养对象。该筛选过程得到的杂交瘤细胞是产生_____________的杂交瘤细胞，接下来要经过_____________检测来获得产生特定蛋白的杂交瘤细胞。最终将纯化得到的特定蛋白结合上荧光或放射性标记，即为蛋白质探针。(2)上述HAT培养基是_____________(填“液体”或“固体”)培养基。融合成杂交瘤细胞后再检测寻找产生特定目标蛋白的杂交瘤细胞，而不直接在脾细胞中寻找产生特定蛋白的B淋巴细胞的原因是_____________。Ⅱ、不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。该方法制备的ssDNA结合上荧光或放射性标记，即为核酸探针。(3)不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。两者的比例通常为1:100。PCR反应的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。据下图可知，最后大量获得的ssDN