脑神经电分析化学

全文速览大脑是认知、情感等神经活动的物质基础。脑内神经元通过化学信号及电信号相互连接，共同构成动态而复杂的神经信号网络，实现各项神经活动。因此，对于脑神经化学分子的分析与检测有助于揭示神经生理、病理过程中的分子机制，进而发展神经系统疾病的精准诊断及治疗手段。随着各学科的融合与发展，已有多种分析技术在不同层次实现神经分子的检测。其中，电化学分析方法具有高灵敏、高时空分辨等优势，有望在活体层次上精准描述特定神经分子在神经生理或病理过程中的动态变化。本文围绕选择性以及生理兼容性两大关键问题，以本课题组最新研究进展为例，系统阐述了电极界面的构筑原则以及电位型检测方法的独特优势，着重介绍了抗坏血酸在神经生理和病理过程中的动态变化规律，并对脑神经电化学分析领域的发展前景进行了展望。背景介绍大脑是人类目前所知的结构最复杂，功能最精密的器官之一。在人类大脑中，数百亿的神经细胞共同构成神经网络，以电信号及化学信号传递信息，实现感知、学习、记忆等生命活动。近年来，在各领域研究团队的共同努力下，有关脑结构与脑功能的神经网络图谱已初现雏形。这些研究在突触、细胞、神经环路和活体等多个层次展开，旨在理解人类各项复杂神经生理过程的物质基础，以及神经系统疾病的形成过程与发展规律。在此基础上，如何在活体水平上实时获取脑内神经分子的动态变化信息仍是揭示神经生理病理过程中分子机制的关键所在。目前，用于活体检测的技术可分为非侵入式及侵入式两大类。其中，非侵入式技术（例如：功能磁共振成像技术，荧光成像技术）可在对脑组织无损伤的基础上，跨尺度监测神经活动模式；而侵入式技术则具有高的时空分辨率，适用于精准监测特定神经化学物质在各种神经活动中的动态变化规律。两类技术手段互为补充，为揭示大脑神经活动的奥秘提供研究工具。本文亮点本文综述了本课题组在脑神经活体化学传感分析研究中的进展，主要围绕该领域研究中选择性和生理兼容性两大关键问题展开，重点总结了界面电子转移对活体传感选择性的调控规律、原电池型氧化还原电位分析法的提出和建立、活体电化学传感方法在实际研究的应用等。图文解析高选择性活体电化学传感。中枢神经系统环境复杂多变，其中多种共存的神经化学物质结构和性质相似，为活体电化学检测的选择性提出了极大挑战。为实现高选择性活体电化学传感，电极界面的设计和合理构筑至关重要。下文将以本课题组进展为例，归纳用于构筑电极选择性传感界面的不同策略，总结界面电子转移对活体传感选择性的调控规律。1）使用生物识别元件。天然酶具有特异性识别、响应时间短等特点，在活体电化学传感中展现出独特的优势。其中，氧化酶和脱氢酶是两类最常用于构筑传感界面的天然酶。经过多年的探索实践，本课题组已创建了基于氧化酶/脱氢酶的在线电化学传感系统（onlineelectrochemicalsystems,OECSs），实现了多种重要神经化学物质的活体连续检测。然而，基于氧化酶/脱氢酶的生物传感器通常会受到由氧分压及辅酶浓度波动带来的干扰，探索新型酶传感原理是解决这一关键问题的突破口。2018年，我们率先提出将谷氨酸合成酶作为选择性检测的生物识别元件，通过引入具有不同氧化还原电位的介体，可实现催化谷氨酸合成及谷氨酸氧化两个反应过程（图1A）。该酶在催化谷氨酸氧化过程中既不受氧气干扰，也无需额外添加辅酶，为脑内谷氨酸活体电化学传感分析提供新的思路。除此之外，核酸适配体（Aptamer）也是一类具有高选择性的生物识别元件。在早期工作中，为解决aptamer识别ATP选择性较差这一难题，我们报道了一种双识别单元的检测策略，通过结合aptamer对A碱基的识别能力与聚咪唑阳离子刷（Polyimidazolium-brush,PimB）对三磷酸根较强的结合能力，实现了高选择性、高灵敏度ATP活体电化学传感检测。随着界面功能化方法的逐步成熟，近期我们成功将aptamer修饰于碳纤维微电极表面，实现了鼠脑内多巴胺的高选择性活体原位检测（图1B），为基于aptamer的生物电化学传感器界面构筑提供了新的策略。

图1

(A)

介体介导的谷氨酸合成酶催化电子传递途径示意图；(B)基于Aptamer的电极界面示意图及电刺激鼠脑内多巴胺动态变化的电流响应曲线。2）形式电位排序指导的界面设计。基于课题组的研究积累，归纳并提出了按照生物分子形式电位(E0’)排序指导界面设计的新构想：对于E0’排位占优的分子，通过构筑电化学活性高的界面，实现“优中选优”。以抗坏血酸（即维生素C）为例，通过利用其E0’排位占优的特点以及碳纳米管优良的电化学特性，我们构筑了基于碳纳米管的传感界面，实现了抗坏血酸在几乎零过电位下的电化学氧化，并创建了活体选择性传感检测抗坏血酸的原理与方法。对于E0’排位不占优的分子，通过调控界面对于待测物及干扰物的活性高低，实现“按需设计”。在下文中，我们以单原子催化剂（singleatomcatalysts,SACs）以及石墨炔材料（graphdiyne,GDY）为例，对上述构想进行详细说明。单原子催化剂通常指催化活性中心以相互孤立的单个原子形式存在的负载型催化剂，因具有几乎100%的原子利用率和丰富可调的配位环境，而展现出极高的催化活性和独特的催化选择性，近年来得到了广泛关注。氧气是一类重要的生理小分子，其E0’排位不占优，在传统Pt电极上四电子氧气还原与两电子H2O2还原难以区分。鉴于此，我们设计并制备了以Co为活性中心，以N掺杂的空心碳球为基底的单原子催化剂（Co-N4/C）。在生理检测条件下，H2O2在Co位点上的吸附受到抑制，其还原电流明显降低，从而使抗H2O2干扰的高选择性氧气活体传感成为可能（图2A）。通过调控催化金属中心与吸附物之间的相互作用，单原子催化剂在活体电化学传感领域展示出新的应用前景。在随后的研究工作中，我们继续利用单原子催化剂这一优势，成功实现了一氧化氮（图2B）、葡萄糖（图2C）等E0’排位不占优生物分子的高选择性活体传感分析。

图2

(A)Co-N4/C单原子催化剂结构与催化性能表征；(B)柔性可拉伸传感器示意图及一氧化氮检测结果；(C)在线电化学传感系统装置示意图及鼠脑葡萄糖检测结果。石墨炔材料是一类新型的二维碳同素异形体，因具有丰富的碳化学键与独特的电子结构，正逐渐成为本领域研究的前沿与热点。例如，石墨炔共轭体系中富含炔键，还原电位较低，可作为基底同时还原并稳定金属催化剂，进而调控其催化性能。以贵金属Pd为例,K2PdCl4可在石墨炔表面自沉积形成均匀的原子簇，并显示出优良的化学催化活性（图3A）。自沉积法操作简单且适用于多种金属，有望作为通用的电催化剂制备方法，满足活体传感应用中对于催化选择性的不同要求。为探索石墨炔的本征性质，我们发展了基于Li2SiF6/K2SiF6的石墨炔水相剥离方法（图3B）。剥离过程可简要描述为：SiF62-以强非共价相互作用与石墨炔结合，使体积较小的阳离子（Li+及K+）扩散进入石墨炔层间，削弱石墨炔片层之间的相互作用力，实现剥离。该方法具有条件温和、材料无损等优势，制备得到的单片层、少数片层石墨炔可直接通过旋涂等方式用于传感器构筑。为进一步调控石墨炔表面电子结构，我们利用强酸处理石墨炔，在其表面引入丰富的含氧官能团。制备所得的氧化石墨炔（graphdiyneoxide,GDYO）对水分子表现出极高的吸附速率，可用于构建高性能湿度传感器，实现了人体与动物的呼吸频率的实时监测（图3C）。在这些研究的基础上，我们将氧化还原分子亚甲基绿（methylenegreen,MG）嵌入石墨炔片层之间，调控待测物与干扰物的电子转移途径，实现了高选择性生物电化学传感。作为一种本征半导体材料，石墨炔可使电化学活性分子的电子隧穿速率大大降低；而层间的MG分子可催化NADH氧化，并以自交换形式快速传递电子。通过结合葡萄糖脱氢酶（glucosedehydrogenase,GDH），我们构筑了葡萄糖传感界面，实现了高选择性生物传感检测。

图3

(A)自沉积制备方法原理示意图；(B)液相剥离石墨炔材料表征结果；(C)氧化石墨炔材料用于实时监测呼吸频率；(D)石墨炔调控电子转移途径示意图及电化学传感器对不同神经化学物质的电流响应对比。3）调控离子传输的活体传感分析。在脑内复杂的环境中，大多数生理活性分子难以通过直接电解的方式实现活体传感分析。针对这些电化学活性较差分子的检测，调控离子传输有望实现这类分子的活体电化学传感分析。在下文中，我们将以离子电流整流（ioncurrentrectification,ICR）为例，展开讨论。在相同电压驱动下，正向与逆向的离子电流大小不同的现象即为离子电流整流，这种现象通常由生物或纳米结构离子通道中阴阳离子的不对称传输引起。然而，由于具有纳米尺度的玻璃管尖端机械强度较差、脆而易碎，难以植入生物体内实现活体原位电分析化学研究。针对这一难题，我们对玻璃微米管内表面可控修饰方法进行了系统探索，并最终利用聚咪唑阳离子刷（PimB）功能化的微米管，成功观察到微米尺度下的整流现象（microscaleioncurrentrectification,MICR）。通过结合实验结果与理论计算，我们提出了适用于MICR的“三层”理论模型（图4A），并对其影响因素进行了详细讨论。随后，我们将ATPaptamer与PimB功能化的微米管结合，用以测定大脑皮层ATP基础浓度，成功构建基于调控传输的活体脑化学传感分析新原理和新方法。为进一步提高传感检测的时空分辨率，以实现脑内生理活性分子快速变化的实时检测，我们通过施加高频方波脉冲电压的方式，提出了基于瞬态离子传输行为的传感原理。待测物与管内壁功能化分子快速吸附/脱附过程可改变管内电荷密度，进而影响管内离子浓度，使离子电流发生变化（图4B）。以脑内pH检测为例，通过将聚1-乙烯基-3-丁基咪唑刷（poly(N-vinylimidazole)-brush,PvimB）功能化的微米管传感器植入鼠脑内，可以实现由CO2刺激引起脑内pH变化的实时检测。该传感器具有高灵敏度、高选择性、高稳定性等优势，时间分辨率可达毫秒量级，为动态监测脑内电化学活性较差的分子变化规律提供了可能。

图4

(A)离子电流整流现象及“三层”理论模型；(B)鼠脑内pH监测原理示意图。生理兼容的活体电化学传感。诚然，基于伏安法及安培法的活体电化学传感是探究脑内神经活动分子机制过程中至关重要的研究方法。但值得注意的是，这类基于电解池原理的传感器，通常需要额外施加电压用以驱动待测物的氧化还原过程。在检测过程中，由此产生的电流不仅可能会对神经元造成损伤，同时也将对神经元电信号的记录产生干扰。电势法为该生理兼容性问题提供了有效的解决策略。离子选择性电极是一类发展较为成熟的电势法传感器，为了探索其在活体离子检测中的应用，我们将H+敏感膜与碳纤维微电极结合，设计并制备了微型化的H+选择性电极（CF-H+ISEs）。该电极在活体检测中表现出良好的选择性、可逆性及抗蛋白吸附能力，可用于实时监测酸碱紊乱模型中大鼠杏仁核脑区的pH变化。在随后的研究中，我们利用碳材料作为转导层，构筑更加稳定的传感界面，成功实现对大脑皮层细胞外K+及Ca2+浓度的活体检测。然而，选择性渗透膜的种类有限，如何适用于大多数生理活性分子的检测仍是电势法在活体传感领域面临的关键问题。为此，我们提出了基于原电池原理的氧化还原电势分析法（GalvanicRedoxPotentiometry,GRP）。由于回路具有高阻抗，故回路中电流很小，电极过程近似处于热力学平衡态。当阴极还原电位正于阳极氧化电位时，整个回路中的电化学过程即可自发进行，系统输出的电压值可以作为定量物质浓度的参数，以此实现电化学传感分析的目的（图5A）。理论上，氧气具有较高的还原电位，可以作为阴极还原的电化学物种，而漆酶则是催化氧气还原效率最高的催化剂之一。我们发现，漆酶不仅可以在碳纳米管修饰的电极上实现直接电子转移，且通过向溶剂中加入乙醇的方式实现优化漆酶排布取向，进而使催化电流得到明显提升（图5B）。由此，可建立脑内抗坏血酸原位活体GRP检测方法，并成功实现了大鼠全脑缺血/再灌注过程中脑内抗坏血酸动态变化监测（图5C）。在此基础上，我们利用自发双极化行为，设计并制备了单根碳纤维驱动的GRP传感器。由基础电化学原理出发，我们探讨了传感器选择性、稳定性、灵敏度的影响因素，并优化了内充液浓度等实验条件。该GRP传感器与多通道阵列电极联用，实现了生理过程中电信号与化学信号的同步记录，有效降低了多模式记录系统之间的干扰，为解析神经活动提供了更为生理兼容的研究方法（图5D）。

图5

(A)GRP传感器示意图；(B)漆酶在碳纳米管上的朝向优化及循环伏安表征；(C)GRP传感器用于脑内抗坏血酸活体传感；(D)单根碳纤维驱动的GRP传感器及多模式同步记录。活体传感的实际应用。依托于本课题组各类活体传感分析方法，我们逐步建立了从实验室研究到应用转化的新模式。在实验室内，我们开展了抗坏血酸、多巴胺、氧气、ATP、葡萄糖、乳酸、儿茶酚胺、K+、Ca2+、Mg2+等多种神经化学分子的高选择性活体传感检测，实现了传统非活体分析难以实现的行为活动过程中生物分子时空变化规律的研究，并相继发现了抗坏血酸随脑内扩散性抑制同步传播现象（图6A）及其在细胞水肿过程中的释放行为（图6B）。走出实验室，活体传感平台展现出巨大的应用转化潜力。北京大学第三医院多个科室采用了本课题组发展的方法开展研究，发现了抗坏血酸、Mg2+、谷氨酸、葡萄糖等分子在耳鸣、眩晕、嗅觉障碍、脊髓损伤、肾缺血等动物模型中的变化规律，为揭示相关疾病的分子机制提供了直接