DMD的基因诊断进修

DMD基因诊断概述单基因病：指由于单个基因的突变而引起的遗传病，其遗传方式符合孟德尔定律。人类大约有2.5万个基因，目前约有2千个单基因病的致病基因被鉴定。基因诊断：利用分子遗传学技术在DNA或RNA水平上对某一基因进行突变分析，从而对特定的疾病进行诊断。多数单基因病目前尚无有效的治疗。对于一些严重的单基因病可通过基因诊断和产前诊断的方法，避免再生育患儿。DMD疾病介绍Duchennemusculardystrophy（DMD）假肥大型（进行性）肌营养不良杜氏肌营养不良儿童最常见的致死性肌肉疾病遗传方式：X连锁隐性遗传发病率：1/3500活产男婴DMD临床特征3～5岁隐袭起病，病情进行性加重，9～12岁不能行走，多于20岁左右死亡。学步较晚，不愿意行走或跑、行走缓慢，活力下降、易于跌倒、不能跳跃、上楼困难。90%有肌肉假性肥大，腓肠肌最明显，触之坚韧。鸭步：骨盆带肌肉无力。Gower征：自仰卧位起立时，先翻身转为俯卧位，屈膝、髋关节，用手按压膝部以辅助股四头肌的肌力，双手攀附下肢缓慢地站立。肩胛带肌受累松弛，呈游离肩；前锯肌和斜方肌萎缩无力，两臂前推或上举时，肩胛骨呈翼状竖立于背部，称翼状肩。大多数伴心肌损害，少数可出现充血性心力衰竭。30%患儿有不同程度的智力障碍。腱反射减弱，直至消失肌酶：CK等活性明显升高肌电图：肌源性损伤免疫组化：蛋白消失或减少。晚期多因呼吸道感染，心力衰竭死亡。BMD：贝氏肌营养不良，临床特征同DMD，发病年龄较晚，进展缓慢，病情较轻，存活期长。DMD基因定位：位于Xp21结构：全长2.5Mb，是人类最大基因；cDNA长14Kb，含79个外显子。功能：表达dystrophin蛋白，具有细胞支架、抗牵拉、防止细胞膜在收缩活动时撕裂。突变类型：缺失型：60—65%；点突变和微缺失：30%；重复型突变：5%发病机制

DMD基因↓dystrophin蛋白↓与肌膜上的其他蛋白形成DAPC复合体↓在细胞外基质和细胞骨架蛋白之间形成一个跨膜结构↓保护肌纤维和肌膜在长期的反复机械收缩过程中免受损伤和坏死DMD的危害发病率高致死性肌肉病多于13岁前失去独立行走能力，青春期后期死亡给家庭带来沉重的精神和经济负担目前没有有效的治疗措施DMD基因检测常用方法18个外显子的多重PCR技术连锁分析——单体型分析胎儿性别鉴定变性高效液相色谱——DHPLCMLPA基因测序多重PCR技术多重PCR（mPCR）在一个PCR体系中由多对不同的引物同时扩增多个不同的DNA片断。DMD基因两组9重PCR

A组：4、8、17、19、44、45、48、51、60号外显子

B组：Pm、3、6、12、13、43、47、50、52号外显子突变检出率：60%左右。mPCR反应体系试剂（Reagents）体积（Volume）10

Buffer1

lMgCl21

ldNTPs(10mM)0.3

lGoldTaq（5U/

l）0.15

lPrimers(100ng/

l）2.5

lDNA模板(30ng/

l)0.7

lddH2O4.35

lmPCR反应条件连锁分析目的：检测携带者非缺失型的产前诊断与mPCR联合分析方法：在DMD基因内部及下游200kb范围选择11个杂合度较高的微卫星（STR）位点，进行单体型分析11个微卫星位点详细情况

Marker名称等位基因5’CA123452CA123457CA1234544CA1234545CA1234549CA1234550CA1234559CA1234563CA1234579CA123453’CA12345PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色各重复片断存在多种形式长度最小的重复片段命名为1依此类推注意：基因内部的交换重组胎儿性别鉴定原理：检测性别决定基因SRY方法：两重PCR扩增SRY、DMD6号外显子（内对照）分析：SRY基因和内对照均有产物为男性有内对照产物而无SRY产物为女性DMD遗传咨询DMD为X连锁隐性遗传病，女性携带者，所生男孩有50%为患儿，所生女孩有50%为携带者。女性携带者中约1.7%可表现有轻重不同的症状，且有较高患扩张性心脏病的风险。先证者的母亲有2/3的可能为携带者。母亲外周血中未检出致病基因：1、先证者为新发突变；2、母亲为生殖腺嵌合体（15～20%）。有DMD家族史或曾生育患儿的女性再生育时须行DMD产前诊断。举例

先证者出生时正常，7岁时因“行走困难”于当地医院诊为“肌营养不良”，现15岁不能独坐，先证者有一舅舅有类似症状，15岁死亡。今先证者姐姐孕23周，要求行DMD基因诊断。先证者DMD

基因mPCR检测结果：47、48、50号外显子缺失。胎儿SRY检测为阴性，说明为女性胎儿。先证者为DMD基因47、48、50号外显子缺失型DMD患者。胎儿SRY阴性，说明为女性胎儿。连锁分析示胎儿遗传了与先证者相同的DMD基因，且未见母源49CA片段，说明胎儿及其母亲均为DMD致病基因携带者。诊断报告咨询意见DMD为X连锁隐性遗传病，胎儿出生后一般不会患DMD疾病，但有文献报道1.7%的DMD女性携带者可表现有轻重不同的症状，且有较高患扩张性心脏病的风险；孕妇及其胎儿均为DMD致病基因携带者，孕妇再生育或胎儿将来生育时需行DMD产前诊断。DHPLC技术变性高效液相色谱（DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC）是一种用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链，从而高通量筛选DNA序列变异的技术，其专利产品为WAVEDNA片段分析系统。DHPLC的核心组成分离柱无孔多苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球体疏水，电中性三乙基铵醋酸盐（TEAA）离子对试剂，其疏水基团与分离柱的疏水基团发生反应,正电荷与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应乙腈将核酸从TEAA上洗脱下来，其浓度越大洗脱立力越强DHPLC的检测类型外显子缺失的检测外显子点突变的检测女性携带者的检测外显子缺失的DHPLC检测

原理：大小和序列不同的片断与分离柱的结合力不同随着乙腈浓度的增高不同的片断将先后从分离柱上洗脱下来用紫外分光仪检测洗脱液浓度的连续变化，有产物的片断将形成峰缺失片断则不形成峰点突变和携带者的DHPLC检测

原理：突变型与野生型DNA杂交形成异源双链和同源双链异源双链和同源双链在某一温度下解链的程度不同所以与分离柱的结合力不同随着乙腈浓度的增高异源双链和同源双链将先后从分离柱上洗脱下来用紫外分光仪检测洗脱液浓度的连续变化，形成异源双峰检测步骤PCR扩增DMD基因上的86个片段各片段的PCR产物分别与相应的野生型PCR产物1：1混合杂交上样检测对于有异源双峰的片断进行测序41号外显子A患者，B母亲，C大姐，D二姐

DNA序列测定原理PCR体系中含有正常dNTP和四色荧光标记的ddNTP。ddNTP的3′端为-H，其不能和后续dNTP形成磷酸二酯键，从而终止延伸。PCR反应中dNTP与ddNTP产生竞争，形成大量不同片断的产物。PCR产物进行毛细管电泳，根据荧光峰识别每一个碱基。MLPA多重连接探针扩增技术(Multiplexligat