DB13-T1767-2013苹果品种DNA指纹鉴定

ICS65.020.20B05

DB13河 北 省 地 方 标 准DB13/T1767—2013苹果品种DNA指纹鉴定20132013090520130930河北省质量技术监督局发布DB13/T1767—2013前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河北省林业厅提出。本标准起草单位：河北农业大学。IIDB13/T1767—2013DB13/T1767—2013DB13/T1767—2013DB13/T1767—2013苹果品种DNA指纹鉴定范围本标准规定了苹果品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。本标准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA指纹库的建立。原理DNADNANASRSSPCRPR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。4溶液配制苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。5鉴定方法样品准备取样量每份送检样品至少检测3个个体，每个个体至少1g，对一致性差的样品应至少检测5个个体。送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。DNADNA5.2DNA提取1CTAB200mg1.5mL500μLDNA1mL30μLβ-5min4℃，12000g8min700μLCTAB65℃60min后于室温冷却4mn～5mi//异戊醇(5∶24∶12000g8min1.5mL(24∶1)，充5min，12000g8min(24∶1)220℃沉30，12000g10min100μLDNADNA检测。PCRSSR基本核心引物名单见附录C。反应体系反应液体积为20μL，组分配制应符合表1的规定（或按比例减少至10μL）。表1PCR反应组分原浓度终浓度反应体积μLddH2O13.3510×buffer10×1×2MgCl225l/L2.5l/L2dNTP2.5ml/L0.15ml/L1.2Taq酶5U/μL1U0.2引物20μl/L0.25μmol/L0.25DNA30~50ng/μL1.~.5n/μL15.3.3反应程序5.3.3反应程序94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。清洗玻璃板，95%涂上0.5mL0.5组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。2显影液中轻轻晃动至带纹出现定影显影液中轻轻晃动至带纹出现定影5in双蒸水漂洗1in灌胶在100mL45%PAGETEMED和25100μL预电泳在正极槽中加入1×TBE缓冲液600mL，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的I×TBE缓冲液600mL，拔出梳子。90W10min~20min。变性在20μLPCR4μL6PCR仪上运行变性程序:95℃变性冷却10min以上。电泳5μL80W40min)银染银染银染10~15in3in110s110s130s6结果及判定3数据表示以多数个具有的带即主作为品的特征带当无法判主带时出各种带所占比率谱带记录式:每个心引物所有谱按扩片从大到小顺序编，用二代码描述依次为、02 )，确定代表条谱带一套标准种每个待测品种每个引物点上的带号用四代码描述，参照标准品种确定待测品种的谱带号。示例1：在一个核心引物上仅有一条谱带02，品种在该引物位点的谱带代码为0202；示例2：在一个核心引物上有两条谱带02和03，品种在该引物位点的谱带代码为0203。17DNA17DNA172＝1＝0bc1734DNA2c)品种间差异位点数＝0，判定为相同或极近似品种。6.3鉴定报告鉴定报告书格式见附录D。4c)品种间差异位点数＝0，判定为相同或极近似品种。6.3鉴定报告鉴定报告书格式见附录D。4附录A（规范性附录）仪器设备及试剂仪器设备PCR96孔;3000V,400mA,400W;水平摇床;胶片观察灯;电子天平;微量加样器;磁力搅拌器;高速离心机高速离心机高压灭菌锅;pH酸度计。A.2试剂所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。Tris碱;盐酸;氢氧化钠;10×Buffe:缓冲液;:4dNTP;TaqDNASSR引物;矿物油;5澳酚蓝;二甲苯青FF;丙烯酰胺;硼酸;脲素;亲和硅烷:97剥离硅烷:2无水乙醇;(TEMED)过硫酸铵;冰醋酸;硝酸银;A.2.24甲醛溶液:37%。A.2.24甲醛溶液:37%。6附录B（规范性附录）溶液配制DNA0.5mol/LEDTA溶液186.lg800NaOH8.01mol/LTris-HCI60.55gTrisHCI8.0500高压灭菌。洗涤液100Mris-HC,lH8.0;50MED;1Ml1β-巯基乙醇;%PCTAB100100ol/Lris-HCl（020ol/LED-Na1.4l/aC2%C0.%（V/V）的β-巯基乙醇(注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌之后加入巯基乙醇)酚/氯仿/25：24：1。TE缓冲液1ll/Lris-HC15，0.5ol/LEDA1，加I调H至8.0500。TE缓冲液2ll/Lris-HC15r，0.5l/LEDA1，0.5ol/LI100，定容至500。5mol/LNaCI溶液146gNaCI500。B.2PCR扩增溶液的配制dNTP、G、、T100mmol/L20μL720μL.5ol/Lach2.5ol/Lach的工作液。SSR引物4l/L0μ1/L的工作7液。注:干粉配制前应首先快速离心。B.2.3649，0.5l/L的EDA溶液()1，澳酚兰0.1250.125。40%PAGE胶190g10g500。4.5%PAGE胶450g，10TBE100112.5。Bind缓冲液49.75250μL50。1mLBind5μLBind2%二甲基二氯硅烷。2%二甲基二氯硅烷。B.3.625%0.25g1超纯水中。10×TBEris碱108，硼酸55，0.5l/LEDA溶液37L，定容至100。1×TBE10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。B.4银染溶液的配制固定液1001000。染色液2g1000。显影液1000mL蒸馏水中加入30g氧氧化钠和5mL甲醛。8附录C（）标记位点染色推荐5’-’）（5’-’）CH03g121IGCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTGCH02b102ICAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTGCH03g073IAATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTTCH02h11a4ICGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTCCH03a095IGCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGGCH03d126IGCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGGCH02a047IGAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGGCH01c068ITTCCCCATCATCGATCTCTCAAACTGAAGCCATGAGGGCCH01f03b9IGAGAAGCAAATGCAAAACCCCTCCCCGGCTCCTATTCTACCH02a0810IGAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCCCH02d0811ITCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTCCH01F0212IACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGCCH05c0413ICCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGGCH03d0814ICATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGACH02c0915ITTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATGCH05a0416IGAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCCCH01h0117IGAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTTHi02c071IIAGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGGCH02c02a2IICTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTCMS14h033IICGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATACH04e024IIGGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTATCH05f065IITTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAGCH03d076IICAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTACH04e057IIAGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCATCH01f098IIATGTACATCAAAGTGTGGATTGAATTCCAATTTCAGAACAGGCH01h029IIAGAGCTTCGAGCTTCGTTTGATCTTTTGGTGCTCCCACACCH02B03b10IIATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTGCH04g0711IICCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGACH04d0212IICGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACTCH03a0813IITTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACGCH03g0414IIATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTTCH02d1115IIAGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGCCH04f1016IIGTAATGGAAATACAGTTTCACAATTAAATGCTTGGTGTGTTTTGCCH05g0317IIGCTTTGAATGGATACAGGAACCCCTGTCTCATGGCATTGTTG注：I型标记含首先采用的17对引物，II型标记含候补采用的17对引物。99附录D（规范性附录）苹果品种DNA指纹鉴定报告书检单位： 地址：