(7.27)-中文版QIAGEN Plasmid Purification H细胞生物学

QIAGEN®PlasmidPurificationHandbook

使用前注意事项：1．

在提low-copy（低拷贝）增加lysisbuffer（裂解液）体积可以提高碱性裂解的效率以及DNA的产量。2．

BufferP1在使用前加RNaseAsolution（RNA酶溶液），一瓶BufferP1加入一小瓶RNaseA（用前瞬时离心），终浓度为100ug/ml。3．

检测BufferP1是否有因低温储存而引起的SDS沉淀。如有必要，将SDS在37℃溶解。4．

BufferP3在4℃下预冷。5．

选择性操作：把提供的LyseBluereagent（LyseBlue试剂）加入到BufferP1并在用前混匀。一瓶BufferP1加一小瓶LyseBlue（用前瞬时离心），这样LyseBlue被稀释1000倍。步骤（蓝色为大提的量，括号里为中提的量。）1.

在选择平板上挑选一个单克隆，在相应抗性的LB2—5ml中进行初培养：37℃摇床约300rpm下初培养约8h。

（使用的管子或烧瓶至少是培养体积的4倍。）2.

将初培养菌液用选择性LB培养基稀释到1/500到1/1000。High-copyplasmid（高拷贝质粒）：用100-200ul（25-50ul）初培养液接种100ml（25ml）介质。Low-copyplasmid（低拷贝质粒）：用250-500ul（100-200ul）初培养液接种500ml（100ml）。37℃摇床约300rpm下初培养约12-16h。

（使用的烧瓶或容器至少是培养体积的4倍。培养细胞的浓度要达到约3-4×109个/ml，也即是每毫升的细胞干重约3g左右）3.

4℃离心机6000×g离心15min收集细菌细胞。

（如果想在此步骤停止以后再做，把细胞-20℃冻存。）4．10ml（4ml）BufferP1重悬细菌细胞。（为了使裂解液充分混合进而能有效溶解，需使用较大的容器。并确保BuferP1里已经加入RNaseA。如果BufferP1里已经加入LyseBluereagent，为确保LyseBlue颗粒完全重悬使用前摇一下Buffer瓶子。为使细菌完全重悬，可以斡旋或者用胶吸管来回上下打散细胞直到没有细胞团留下为止。）6．

加入10ml（4ml）BufferP2，上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液，室温（15-25℃）下放置5min。

（不要斡旋，因为斡旋能导致基因组DNA被剪断。裂解液会有粘性。溶解反应不要超过5min。装有BufferP2的瓶子用后要立即盖紧，以免被空气中的CO2酸化。如果BufferP1里加有LyseBlue，那么在加入BufferP2后细胞悬浮液会呈现蓝色。混匀后悬浮液的颜色会很均一。如果悬浮液仍有无颜色区或者褐色细胞团存在，请继续混合直到颜色均一为止。）6．加10ml（4ml）预冷的BufferP3，立即上下颠倒4-6次混匀，然后放冰上20min（15min）。（预冷的BufferP3和冰上放置能促进沉淀。加入BufferP3后有乳白色的物质形成且裂解液粘性度减少。沉淀物中含有基因组DNA、蛋白质、细胞残渣和KDS。为保证potassiumdodecylsulfate（十二烷基磷酸钾）沉淀，裂解液要充分混合。若混合液依旧粘稠，请继续混合彻底中和溶液。如果使用了LyseBlue试剂悬浮液混匀后蓝色要彻底消失呈现无色。悬浮液均匀无色表明SDS已完全沉淀。）7．

≧20,000g4℃离心30min。立即转移含有质粒DNA的上清液。（离心前样品需再次混合。离心要在非玻璃管（如聚丙烯）内进行。离心后上清液应是清晰透明的。）8．

把上清液≧20,000g4℃离心15min。立即转移含有质粒DNA的上清液。（进行第二次离心是避免仍有悬浮或颗粒物质存在于QIAGEN-tip。是样品浑浊的悬浮物质能阻止QIAGEN-tip并且会降低或消除重力流。→（样1）从清晰的裂解上清液里取120ul（240ul）样品保存以备跑分析胶确定生长和裂解状态是否最佳。）9．

用10ml（4ml）BuferQBT平衡QIAGEN-tip500（QIAGEN-tip100）以使柱子为空重力流。（因为平衡液中有洗涤剂存在，buffer流将通过降低表面张力自动开始。使得QIAGEN-tip彻底排空。因为当半月液面达到柱子的上个玻璃面时buffer流会停止，所以QIAGEN-tip可以无人看着。）10．从第8步道到QIAGEN-tip用上清液使它通过重力流进入树脂。（上清液应该立即转移到QIAGEN-tip上。如果放置时间过长或者由于蛋白过度沉淀使上清液变得不透明，在转移前请再次离心或者过滤以避免阻碍QIAGEN-tip。）→（样2）从逆流道中取样120ul（240ul）样品保存以备跑分析胶确定DNA结合QIAGEN树脂的效率。）11．用2×30ml（2×10ml）BufferQC洗QIAGEN-tip。（BufferQC通过重力流通过QIAGEN-tip。第一次清洗就足够去除大部分质粒DNA沉淀中的污染物。但是，当培养体积较大或者菌种会产生大量的糖类时第二次清洗是必要的。→（样3）从混合的清洗部分取出240ul（400ul）样品保存以备跑分析胶。）12．用15ml（5ml）BufferQF洗提DNA。（把洗出液收集到一个15ml-50ml的管子里（管子自备）。这里不建议用户使用聚碳酸酯材料的离心管，因为聚碳酸酯不抵抗下面使用的酒精。注：对于大于45-50kb的产物，把elutionbuffer在65℃预热可能会有助于增高产量。→（样4）取60ul（100ul）洗出液保存以备跑分析胶。如果想在这一步停止以后再做，把洗出液在4℃保存。贮存时间最好不要长于过夜。）13．向DNA洗提液里加入10.5ml（3.5ml）（0.7体积）的室温异丙醇沉淀DNA。混匀立即在≧15,000×g4℃离心30min。小心转移上清液至另一瓶子。（虽然离心是在4℃进行可以阻止样品过热，但是所有溶液还要放室温以减少盐类沉淀。或者可以用一次性圆锥底的离心管5000×g4℃离心60min。因为异丙醇颗粒是玻璃表面所以可能会比从酒精沉淀产生的柔软的含盐颗粒更难看到。离心前在管的外面坐标记便于小粒的定位。异丙醇小粒在管壁上结合得较松，所以在转移上清液是要非常小心。）14．用5ml（2ml）70%室温保存的乙醇洗涤DNA颗粒，在≧15,000×g4℃离心10min。小心转移上清液至另一瓶子，不要激荡DNA颗粒。（或者可以用一次性圆锥底的离心管5000×g4℃离心60min。70%乙醇可以移去沉淀的盐并用更易挥发的乙醇替换异丙醇，这样更易于DNA的再溶解。）15