实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点及实验报告-偏振光学实验

等电点聚焦测蛋白质等电点实验目的了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。每组4管，每管加胶液1.8ml。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。表1凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯酰胺0.8%）1ml10%过硫酸铵0.02ml水2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED0.02ml2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。固定取其中的凝胶条3根置于一个小培养皿内，倒入10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液用直尺量出胶条长度L1和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度L2。pH梯度的测量切段法：将未经固定的1根胶条，按照从正极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序切成相等的10段，按次放人有标号的、装有0.0lM氯化钾的试管中，浸泡过夜。然后用pH计测出每管浸泡液的pH并记录。实验结果1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置凝胶条编号1234固定前的长度L07.8cm7.8cm7.4cm7.7cm固定后的长度L17.7cm7.8cm7.4cm未染色，测pH梯度蛋白带距酸端距离L21.3cm1.4cm1.3cm蛋白质距正极实际长度LS1.32cm1.4cm1.3cm2.pH梯度表及其相应标准曲线标号12345678910长度/cm0.770.770.770.770.770.770.770.770.770.77pH值3.053.725.046.767.247.998.629.5810.1410.18蛋白质样品等电点的计算：蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度=固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离*固定前凝胶条长度/固定后凝胶条长度则将上述数据代入LS=L2*，求出蛋白质距正极实际长度LS分别为1.3cm、1.4cm、1.3cm。由凝胶条1、2和3及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距离：(1.3+1.4+1.32)/3=1.34②计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。得出其标准公式为：y=0.8372x+2.6273则待测蛋白质的等电点为0.8372*1.34+2.6273=3.75实验分析及讨论（1）实验结果测得的样品蛋白的等电点为3.75，通过查常见蛋白质等电点参考值表格可知，其为β-卵黄脂磷蛋白。由于记录凝胶长度及蛋白质距正极的距离存在读数误差，所以也可能是伴花生球蛋白（3.7-5.0）。等电点聚焦测蛋白质等电点分辨率高，可将等电点相差0.01—0.02pH单位的蛋白质分开。不像一般电泳易受扩散作用影响，使区带越走越宽；聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。同时，很稀的样品也可以聚焦而浓缩，实验操作起来也简单方便。其存在其不足之处是在实验操作过程当中，读数的取值、样品溶液是否含盐、在等电点时蛋白质是否溶解或变性，都会影响实验结果。因为盐会增大电流量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。由于这些影响因素的存在，个人认为利用这一种方法还不足以鉴定出蛋白质种类。附常见蛋白质等电点参考值实验报告姓名：*****班级：*****学号：*****实验成绩：同组姓名：****实验日期：*****指导教师：批阅日期：偏振光学实验【实验目的】1．观察光的偏振现象，验证马吕斯定律；2．了解1/2波片、1/4波片的作用；3．掌握椭圆偏振光、圆偏振光的产生与检测。【实验原理】1．光的偏振性光是一种电磁波，由于电磁波对物质的作用主要是电场，故在光学中把电场强度E称为光矢量。在垂直于光波传播方向的平面内，光矢量可能有不同的振动方向，通常把光矢量保持一定振动方向上的状态称为偏振态。如果光在传播过程中，若光矢量保持在固定平面上振动，这种振动状态称为平面振动态，此平面就称为振动面（见图１）。此时光矢量在垂直与传播方向平面上的投影为一条直线，故又称为线偏振态。若光矢量绕着传播方向旋转，其端点描绘的轨道为一个圆，这种偏振态称为圆偏振态。如光矢量端点旋转的轨迹为一椭圆，就成为椭圆偏振态（见图2）。2．偏振片虽然普通光源发出自然光，但在自然界中存在着各种偏振光，目前广泛使用的偏振光的器件是人造偏振片，它利用二向色性获得偏振光（有些各向同性介质，在某种作用下会呈现各向异性，能强烈吸收入射光矢量在某方向上的分量，而通过其垂直分量，从而使入射的自然光变为偏振光，介质的这种性质称为二向色性。）。偏振器件即可以用来使自然光变为平面偏振光——起偏，也可以用来鉴别线偏振光、自然光和部分偏振光——检偏。用作起偏的偏振片叫做起偏器，用作检偏的偏振器件叫做检偏器。实际上，起偏器和检偏器是通用的。3．马吕斯定律设两偏振片的透振方向之间的夹角为α，透过起偏器的线偏振光振幅为A0，则透过检偏器的线偏振光的强度为I式中I0为进入检偏器前（偏振片无吸收时）线偏振光的强度。4．椭圆偏振光、圆偏振光的产生；1/2波片和1/4波片的作用当线偏振光垂直射入一块表面平行于光轴的晶片时，若其振动面与晶片的光轴成α角，该线偏振光将分为e光、o光两部分，它们的传播方向一致，但振动方向平行于光轴的e光与振动方向垂直于光轴的o光在晶体中传播速度不同，因而产生的光程差为位相差为式中ne为e光的主折射率，no为o光的主折射率（正晶体中，δ＞0，在负晶体中δ＜0）。d为晶体的厚度，如图4所示。当光刚刚穿过晶体时，此两光的振动可分别表示如下：式中轨迹方程原理图全波片1/2波片1/4波片【实验数据记录、实验结果计算】说明：以下的所有测量数据中，电流的单位为，角度的单位为角度。验证马吕斯定律角度0612182430364210.9890740.9567730.9045090.8345660.750.6545090.552265电流0.2090.2060.2010.1900.1750.1570.1370.115角度48546066727884900.4477360.3454920.2500010.1654350.0954920.0432280.0109260电流0.0940.0710.0520.0340.0180.0070.0000.000角度961021081141201261321380.0109260.0432270.0954910.1654330.2499980.345490.4477340.552262电流0.0000.0070.0180.0330.0490.0690.0920.113角度1441501561621681741800.6545060.7499980.8345640.9045070.9567720.9890731电流0.1370.1560.1760.1910.2020.2090.209作的函数图像：Origin的数据分析：LinearRegressionthroughoriginforDATA2_B:Y=B*XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 0 --B 0.20928 4.62343E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------0.99991 0.00162 31 <0.0001------------------------------------------------------------从以上的分析可知，电流大小I关于两偏振片的夹角余弦的平方的数据点的直线拟合的相关系数r=0.99191，可知实际测得的数据点与理论值匹配。线偏振光通过1/2波片时的现象和1/2波片的作用1/2波片转过角度初始102030405060708090检偏器A转过角度018385880100120140------检偏器的角度差---18202022202020------说明：最后两个数据没测，是因为在做的时候一时疏忽了，最后想要补做时，时间已晚，老师建议我们不做了。检偏器的平均角度差度由上面的数据可以明显地看出，1/2波片每转10度，检偏器就需要转20度，与理论值吻合。观察：检偏片固定，将1/2波片转过360°，能观察到4次消光；1/2波片固定，将检偏片转过360°，能观察2次消光。由此分析线偏振光通过1/2波片后，光的偏振状态是：光的偏振面偏离原来的角度是波片光轴偏离角度的2倍。用1/4波片产生圆偏振光和椭圆偏振光波片转20度角度010203040506070电流0.0320.0220.0160.0180.0270.0410.0590.078角度8090100110120130140150电流0.0970.1140.1260.1320.1300.1220.1080.090角度160170180190200210220230电流0.0700.0510.0340.0230.0170.0200.0290.044角度240250260270280290300310电流0.0650.0850.1050.1230.1340.1380.1360.125角度320330340350360电流0.1100.0900.0690.0500.032作角度与电流的极坐标函数图：I~在此基础上作振幅与角度的函数图：A~分析：可以看出，该极坐标函数图象成“双椭圆饼”形，在检偏器所转的0~360度之间，共达到两次消光，两次最大值，这正是椭圆偏振光的长轴和短轴的位置。实验数据图中可以看出，图像少有倾斜，在20度和200度左右达到真正消光，这是因为初始角度原因。波片转45度角度010203040506070电流0.0810.0810.0800.0790.0780.0760.0740.071角度8090100110120130140150电流0.0700.0690.0700.0690.0700.0720.0730.075角度160170180190200210220230电流0.0780.0800.0820.0840.0840.0830.0820.080角度240250260270280290300310电流0.0780.0760.0740.0730.0720.0720.0720.073角度320330340350360电流0.0740.0760.0770.0790.081作角度与电流的极坐标函数图：I~在此基础上作振幅与角度的函数图：A~分析：从图像中可以看出，函数形状成近乎圆的椭圆，理论上应该是圆，还是非常接近理论值。数据在110度和290度左右但到最小值，在20度和200左右达到最大值，这正是椭圆偏振光的长轴和短轴的位置。误差会在后面误差分析部分讨论。【对实验结果中的现象或问题进行分析、讨论】在做验证马吕斯定律的实验时，由于第一遍测量时出错，导致实验的重做，所以在预习报告上有大量修改的痕迹。但是，最后得到的结果非常准确，拟合度极高，也使得多花去的时间很值得。在这里我想重点讨论以下这个实验的一个误差。上面的种种实验皆反映了在消光点的角度误差，而且这个误差不小。误差现象为：在消光点附近的10度左右的范围内，电流计的示数皆为0，所以无法准确地找出消光点的角度。所以实验作出的函数图都有一定的倾斜。在这里提出自己认为可以在一定程度上消除这个误差的方法：缓缓旋转检偏器，记下电流值为0的区间，取这个区间的中点为消光点。误差来源还有旋转的转向误差，这是由于齿轮之间的间隙引起的。误差避免方法：只朝同一方向旋转。手电筒一类的误差：用手电在照波片或检偏器上的刻度时，会导致进入检测器的