SNT 2330-2009化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验2009-07-07发布国家质量监督检验检疫总局I1化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验下列术语和定义适用于本标准。用于维持小鼠胚胎于细胞增殖和未分化的状态的一类生长因子。2半数抑制浓度IDso抑制ES细胞分化为心肌细胞50%的受试物浓度。胚胎干细胞半数致死浓度ICoESES细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。3T3成纤维细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。体外进行。这几种体内和体外试验必须以牺牲动物为代价。本试验基于胚胎毒性作用中最重要的指(AmericanTypeCultureCollect(EuropeanCollectionofCellCultures,ECACC)。DMSO。NAA、0.1mmol/L疏基乙醇、10%DMSO。4.3.1H-DMEM:高糖DMEM,推荐Gibco公司或HyClone公司的产品。4.3.2L-谷氨酰胺。34.3.5胰酶/EDTA(Trypsin/EDTA):配成0.25%。存1周。4℃,可保持活性约1年；原液浓度为10?U/mL的mLIF,可用PBS(含1%BSA)或培养基按1:10稀释后保存在一20℃或4℃。4.3.14磷酸缓冲液(D-PBS):无Ca²+和Mg²+,保存于室温或4℃冰箱中。4.4.1MTT贮存液：通常使用的浓度为5mg/mL。称取MTT0.5g,溶于100mL的磷酸缓冲液4.5.424孔组织培养板。4.6仪器和设备4.6.1培养箱：温度37℃±1℃,相对湿度90%±5%,5%±1%CO₂。4.6.3恒温水浴箱：温度37℃士1℃。4.6.4倒置相差显微镜。参照附录A把受试物溶解在合适的溶剂中。所选择的溶剂其浓度不能具有细胞毒性和对细胞分化有任何影响，且该浓度在试验过程中应始终保醇为0.5%。距离的3个间隔。稀释因子1|78(=√10)将一个log单位分成等距离的4个间隔。稀释因子1.47(={10)将一个log单位分成等距离的6个间隔。稀释因子1J21(=√10)将一个log单位分成等距离的12个间隔。以因子1.47作为例子。加入0,47体积的稀释液稀释1体积最高浓度的溶液，混合进制序列稀释液。正式试验应设7个浓度的阳性对照物质(见5.33)。a)任何化学物质的最大试验浓度是1600gg/mL;c)提前制备贮存液，包括阳性对照物5-氟尿嘧啶、双抗、阴性对照物青霉素G等可以冻存于液应用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸中和；g)对未知受试物进行细胞毒性试验(见5.3)前，应测定含最高受试物浓度的检测用培养基(方2h)在550nm～570nm处的绝对光密度学反应。测得的OD值应>0.05。如OD值小于此值，而且所代表的浓度恰好在预期的IC55.2mES细胞分化能力检测5.2.1mES细胞悬液制备mES细胞的维持培养参见附录B。为防止mES细胞贴壁，用60mm培养皿制备浓度约为3.75×10⁴个细胞/mL的mES细胞悬液。用台盼蓝染色法检查mES细胞的细胞活力，如活力≥90%则细胞用于试验。试验过程中应不断轻微晃动细胞以保持细胞处于悬浮状态，并尽可能缩短培养箱外停留5.2.2试验程序(参见附录C)盖倾斜约45°以使胚胎体(EBs)滑落底部,用5mL移液器(避免损伤EBs)轻轻将所有细胞悬液转移至制备不同浓度的受试物溶液，每一浓度的测试化学物、空白对照和溶剂对照分别各自使用一个24孔板。往24孔板的各孔中加入1mL同一浓度的测试溶液。用吸头以约40μL体积每孔加1个EBs,5.2.3结果观察试验第10d时，相差显微能下仔细规察每个培养板各孔含自主收缩心肌细胞的孔数，并记录。5.2.4.2细胞质量控制试验结果可接受。比较空白对照板数据(mES检测培养基)和溶剂对照极的数据可确定溶剂对mES分每批FCS都要在无化学物质下进行分化能力测试，结果应是24孔中至少21孔出现心肌细胞，并少2次。5.3.1.1第一步(第0天)mES细胞和3T3细胞的常规培养参见附录B。mES细胞和3T3细胞的细胞毒性检测采用96孔6细胞浓度为500细胞/孔。可用台盼蓝染色检查细胞活性，活力>90%可进行试验。5%CO₂37℃孵育ABCDEFGHbbbbb雄bbbbb.bbbbbbbbbbbbbbbbbbb.bbbbbCO——溶剂对照；b——空白(检测培养液);C₁~C;——八个浓度的受试物(C;最高浓度，C最低浓度)。注：当进行质量控制时(见5.3.3.2),C～C。则为不同浓度的阳性对照，空白对照为1000U/mL青霉素G。图196细胞毒性试验溶液分布图5.3.1.2第二步(第3天)备的试验液(终浓度同第0天)。5%CO₂37℃继续培养2d。5.3.1.3第三步(第5天)新的试验溶液(每孔终浓度与0d相同),再培养5d。第5.3.3.1细胞质量控制孔板的2和11列),按置信限范围应在0.15～0.8之间或0.90~1.6之间；3T3细胞的ODssoso,95%置信限范围应在0.15～0.6之间。7进行检查过程的质量控制。用于mES和3T3的最高测试浓度是1μg/mL5-FU(用PBS制备2mg/mL的IC₅值的范围分别应该在0.048μg/mL～0.086μg/mL之间和是0.12μg/mL～0.5pg/mL之间。一个浓度的青霉素G(1000U/mL)置于培养板的同一列(3列),青霉素G浓度应该对细胞的活力无影响。每个细胞毒性检测除包括7个稀释度的测试化学物外，还包括1个固定稀释度的阳性对照化学物5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶的采用浓度来自mES和3T3细胞的ICs₀的历史平均值，对于3T3细胞和mES细胞分别是0.29pg/mL和0.06pg/mL。在这一浓度下，抑制率应该在20%～80%的范围内。分别计算mES细胞分化抑制50%的受试物浓度(IDso)、mES细胞生长抑制50%的受试物浓度试验第10天，记录溶剂对照24孔培养板中出现收缩的心肌细胞的孔数，设此数为100%;记录每(%);采用电子记录表的形式记录数据。按6.1,计算ID₅₀。值设为100%细胞活性。测定4到10列每列的平均OD度将是1000μg/mL。而且在判别函数中将检测终点进行了变量转换，即IC₀3T3转变为lg(ICs₀3T3),将ICs₀ES转变为lg(ICs₀ES),将ID₀转变为(IC₀3T3-IDso)/ICso3T3。6.3.2线性判别函数I=5.916lg(IC₀3T3)+3.500lg(IC₀ES)一5.307[(ICs₀3T3-ID₀)/ICs₀3T3]-15.27 Ⅱ=3.651lg(ICso3T3)+2.394lg(ICs₀ES)一2.033[(IC5₀3T3—IDo)/IC₀3T3]—6.85 (2)Ⅲ=-0.125lg(ICso3T3)-1.917lg(ICs₀ES)+1.500[(IC5₀3T3-ID₃o)/IC₀3T3]-2.67 (3)8ICES为ES细胞活力抑制50%的受试物浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)IC₅₀3T3——为3T3成纤维细胞活力抑制50%的受试物浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);ID为ES细胞分化为心肌细胞抑制50%的受试物浓度，单位为微克每毫升(μg/mL),如I>Ⅱ,且I>Ⅲ,判断受试物无胚胎毒性；如Ⅱ>I,且Ⅱ>Ⅲ,判断受试物弱胚胎毒性：如Ⅲ>I,且Ⅲ>Ⅱ,判断受试物强胚胎毒性。9受试物溶解液配制试验程序解于PBS或DMEM?解于PBS或DMEM?否是是是是解于PBS或DMEM?100mg/mL受试物溶否15mg/mL受试物溶1:400稀释后无沉淀?否在前两步之间找到最子3)解于DMSO,培养基市操作程序同上否不相溶或使用其他溶剂注：用于细胞毒性和分化检测的最高溶剂浓度是：乙醇0.5%,含50%乙醇的PBS1%,DMSO0.25%、细胞维持和培养程序B.2胰酶消化液。加1mL～2mL预温的0.125%胰酶/0.01%EDTA液于单层细胞，作用几秒；加6mL培养基中止消化；吹打使细胞悬浮；1000r/min离心3min～5mB.5冻存mES和Balb/c3T3可保存在无菌、冻存管中，DMSO为细胞保存剂。胰酶消化细胞离心200g10min;弃去上清液，重悬细胞于冻存培养基中，细胞浓度1×10/mL～5×10⁶/mL,每支冻存管1mlB.6复苏将冻存管放入37℃水浴，不超过1min;用含培养基重悬细胞，离性试验。复苏后细胞传代不能超过25代(如每周传3代，不超过2个月)。mES细胞分化试验流程十个24孔板，对照组为检测培养基),孵育5d,分化形成心肌细胞。见图C.3。图C.3心肌细胞分化(资料性附录)mES细胞和3T3细胞毒性试验流程接种96孔板：500细胞/50μL3T3或mES检测培养基/孔孵育2h第一步加150pL溶解受试物的3T3或mES检测培养基(8个浓度)(对照组为3T3或mES检测培养基)第二步加200μL溶解受试物的23或mES检测培养基(浓度与第一步相同)(对照组为3T3或mES检测培养基)(对照组为33或bES检测培养基)孵育(5%cb₂37℃)5,d摇动15min测定570nmOD值，参考波长630nm图D.1mES细胞和3T3细胞毒性试验流程试验说明：试验开始日期试验完成日期受试物名称(中英文):CAS编号(如已知):溶剂名称(如使用):溶剂百分比(体积分数pH值(最高浓度测定):是否中和及中和液贮备液浓度：终溶剂浓度细胞系名称：来源.供应商：解冻后传代数：总传代数(如已知):细胞培养条件培养基名称：供应商：批号：血清名称：供应商：批号：血清浓度：生长期%干预期%试验接受标准(√)CO:平均绝对OD560值平均OD(值=接受()拒绝()P:同时进行的5-FU测试的IC。值拒绝()试验结果化学物浓度/(pg/mL)OD560平均值土标准差活力/%平均值士标准!苦VC=0签名：日期：表E.2ES细胞MTT毒性试验记录表试验说明：试验开始日期试验完成日期受试物名称(中英文):CAS编号(如已知):溶剂名称(如使用):溶剂百分比(体积分数):pH值(最高浓度测定):是否中和及中和液：贮备液浓度：终溶剂浓度：细胞系名称：来源：供应商：解冻后传代数：总传代数(如已知):细胞培养条件培养基名称：供应商：批号：血清名称：供应商：批号：血清浓度：生长期%干预期.%试验接受标准(√)CO:平均绝对OD560值接受()拒绝()P:同时进行的5-FU测试的ICo值接受()拒绝()阳性对照物及历史数据：试验结果化学物浓度/(μmol/mL)OD560平均值士标准差平均值士标准差VC=0lg(ICrs)=Cl=C2=C3=C4=C5=C6=C7=签名：日期：表E.3ES细胞分化试验记录表试验说明：试验开始日期试验完成日期受试物名称(中英文):CAS编号(如已知)