T-CPMA 032-2023 病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法 施万菌

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11.020学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载CCS

C

04 T/CPMA

032—2023病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法施万菌

—Shewanella

spp.2023

-

10

–

发

布兔兔ｗ学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023兔兔ｗ学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载 前 言

...........................................................................

II1

范围

................................................................................

12

规范性引用文件

......................................................................

13

术语和定义

..........................................................................

14

缩略语

..............................................................................

15

设备和材料

..........................................................................

16

培养基和试剂

........................................................................

17

分离和鉴定程序

......................................................................

28

操作步骤

............................................................................

3样品类型和处理

..................................................................

3

............................................................................

3分离培养

........................................................................

3初步鉴定

........................................................................

3微生物自动鉴定系统实验

..........................................................

4

确证实验.....................................................................

4附 录 A （资料性）

施万菌病原学....................................................

7附 录 B （规范性）

设备和材料......................................................

8附 录 C （规范性）

培养基和试剂....................................................

9C.1

施万菌增菌液.....................................................................

9C.2

硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂...........................................

9C.3

营养琼脂.........................................................................

9C.4

三糖铁琼脂（）................................................................

9C.5

氧化酶试剂......................................................................

10C.6

5×

电泳缓冲液................................................................

10附 录 D （规范性）

施万菌种水平的鉴定（

法）

..................................

11D.1

核酸模板制备....................................................................

11D.2

反应体系

...................................................................

11D.3

扩增条件....................................................................

11D.4

扩增产物分析

...................................................................

11D.5

MLSA

进化树

................................................................

11D.6

结果判定

.......................................................................

12参 考 文 献

.......................................................................

13学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载 本文件按照GB/T

1.1—2020《标准化工作导则

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提出。本文件由中华预防医学会归口。病预防控制中心、中日友好医院、北京市顺义区疾病预防控制中心。蔡红艳、肖悦、高鹤、白雪梅。II学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1 范围本文件规定了施万菌的分离和鉴定方法。本文件适用于全国各级病原微生物菌（毒）种保藏机构，以及涉及人间传染的施万菌研究、教学、检测、诊断等相关活动的机构。2 规范性引用文件文件。T/CPMA

011

病原微生物菌（毒）种保藏数据描述通则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。施万菌属 Shewanella

HS，在人体可导致皮肤和软组织感染、菌血症、肝胆疾病、中耳炎和其他感染。

4 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（Base

pair）：多位点序列分析（Multilocus

Sequence

）PCR：聚合酶链式反应

（

Chain

Reaction）5 设备和材料见附录B。6 培养基和试剂ｗｗ．ｂｚｆｘｗ兔ｗ兔学．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023ｗｗ．ｂｚｆｘｗ兔ｗ兔学．ｃｏｍ标准下载见附录

C。7 分离和鉴定程序分离和鉴定流程见图

1。样品（临床、食品、环境）样品处理增菌：施万菌增菌液36

℃±1

℃，

h～

h分离培养：

36

℃±1

℃，

h～

h直径

1-3mm、圆形、光滑凸起、绿色不透明，带或不带黑色中心36

℃±1

℃，

h～

h营养琼脂平板初步鉴定：革兰染色（-），氧化酶（+），三糖铁琼脂反应为斜面产碱、底层产酸、产硫化氢微生物鉴定系统鉴定实验PCR

确证实验rpoA

特异基因（+）报告检出施万菌

分析（种水平鉴定，可选）图1 施万菌分离鉴定流程图学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载8 操作步骤样品类型和处理8.1.1 样品类型8.1.1.1

临床样品：包括粪便、尿液、呕吐物、痰液、脑脊液、肛拭子、皮肤化脓性病灶等。8.1.1.2

食品样品：包括乳制品、肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆制品、即食果蔬制品等预包装食品。8.1.1.3

环境样品：包括水体、市场各水产或肉类档口、各超市生鲜类柜台和餐厅厨房的环境，包括案板、器具物表、餐具、储存冰箱或冷库内表面、污水、工作人员手部等多点涂抹样品。8.1.2 样品处理8.1.2.1

临床样品：以无菌操作称取待检样品

g（mL）[不足

0.5

g（）取其全部]，加入装有

10mL

施万菌增菌液的试管中，震荡混匀。8.1.2.2

食品样品：以无菌操作取食品样品

25

g（mL）[不足

25

g（mL）取其全部]，加入装有

225

施万菌增菌液的均质袋，或放入盛有

225

施万菌增菌液的无菌锥形瓶中，用拍击式均质器均质

1

~2

，震荡混匀。8.1.2.3

环境样品：环境物体表面，使用灭菌干燥棉拭子于

10

施万菌增菌液内浸润后，在物体表面的适当部位来回均匀涂抹进行样品采集，再用灭菌剪刀剪去棉签手接触部分，将棉拭子放入增菌液试管中，震荡混匀。环境水体样品量取样品

50

，加入装有

施万菌增菌液的无菌锥形瓶中，震荡混匀。增菌将样品匀液置于恒温生化培养箱，36

±1

18

h

~24

h。分离培养用无菌接种环取增菌液，划线接种

TCBS

琼脂平板，于恒温培养箱

36

±1

培养

18

h

~24

h。施万菌在

TCBS

琼脂培养基上疑似菌落为中等大小、圆形、光滑凸起、绿色不透明，带或不带黑色中心。挑取

3

个或以上可疑菌落，划线接种营养琼脂平板，于恒温培养箱

36

±1

18

h

~24

h。初步鉴定8.4.1 革兰染色镜检8.4.2.1

制片：以接种环取一滴盐水放于玻片上，挑取营养琼脂平板上数个菌落与盐水混匀，均匀涂布，学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载自然干燥，玻片在火焰上来回通过

3~4

次，使细菌固定在玻片上。8.4.2.2

1~2

，水洗。8.4.2.3

媒染：加碘液作用

1

后，水洗沥净。8.4.2.4

的乙醇无紫色时，立即水洗。8.4.2.5

复染：用番红液复染

1~2

，水洗，用滤纸吸干。8.4.2.6

呈杆状。8.4.2 氧化酶实验

s

s

性处理。施万菌为氧化酶阳性。8.4.3 三糖铁琼脂（）实验以接种针挑取营养琼脂上的单个菌落，先穿刺接种到

TSI

深层，距管底

3

~5

为止，再从原路退回，在斜面自下而上划线，于恒温培养箱

±1

培养

18

h~24

h

观察结果。产生黑色沉淀即表明产生了

HS；发酵乳糖或蔗糖的细菌使整个培养基呈现黄色；只能利用葡萄糖的细菌则斜面变红，底部仍保持黄色。施万菌在

TSI

中的反应为斜面产碱、底层产酸、产硫化氢。微生物自动鉴定系统实验挑取疑似纯菌落，按照微生物自动鉴定系统的要求进行操作，鉴定结果为施万菌（Shewanella）或该属的某个种，如海藻施万菌（

algaeShewanella

）时，为施万菌微生物鉴定系统实验阳性。微生物自动鉴定系统包括全自动生化鉴定仪和飞行时间质谱仪。PCR

确证实验8.6.1 核酸模板制备使用

1

μL

接种环刮取营养琼脂上培养

18

h

的菌落，悬浮在

200

μL

0.85%灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于

100

10

；冰浴冷却后，13000

离心

3

，收集上清液作为

PCR

检测的模板；所有处理后的

DNA

模板直接用于

PCR

反应或暂存于

4

并当天进行

PCR

反应；否则，应在

以下保存备用(1

周内)。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。每次

PCR

反应，使用中国疾病预防控制中心病原微生物菌（毒）种保藏中心（CHPC

CHPC

1.2277（国家病原微生物保藏中心编号：NPRC

1.2.743）作为阳性对照。同时，使用气单胞菌

CHPC

1.261

或等效标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照，控制

PCR

体系污染。8.6.2 PCR

反应体系9.610×PCR

2.525

2.52.5

dNTPs3.010×2.510×2.5

0.4

2.025.05'→3'

rpoArpoA-27-F93354rpoA-27-R准ｘｗｚｆ．ｂｗｗ学兔兔ｗ．ｃｏｍ标下载T/CPMA

032—2023准ｘｗｚｆ．ｂｗｗ学兔兔ｗ．ｃｏｍ标下载使用去离子水将合成的施万菌属特异性引物（见表

1）干粉稀释成

100

储存液。继续配制成

引物工作液

2

，PCR

反应体系中引物的终浓度为

0.2

。将

10×PCR

反应缓冲液、25

mmol/LMgCl、2.5

dNTPs、灭菌去离子水从

冰箱中取出，融化并平衡至室温，使用前混匀；5

U/μL

酶在加样前从

冰箱中取出。每个样品按照表

2

的加液量配制

μL

反应体系。表1 施万菌

PCR

实验用引物表2 施万菌

PCR

体系配制表8.6.3 PCR

扩增条件94

预变性

10

，然后

30

s，

退火

表1 施万菌

PCR

实验用引物表2 施万菌

PCR

体系配制表8.6.3 PCR

扩增条件后

72

。8.6.4 扩增产物分析PCR

扩增结束后，取

5

μL

产物上样于

1

%琼脂糖凝胶中，在

V

45

，验证是否为单一条带并位于相应的片段大小位置上。8.6.5 结果判定rpoA

基因阳性者判定为施万菌。8.6.6 种水平的鉴定（选做）学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载见附录

D

（规范性）施万菌种水平的鉴定（

法）。学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载

附 录 A（资料性）施万菌病原学施万菌属（Shewanella

spp.）又称希瓦氏菌属，是一类革兰氏阴性、氧化酶阳性、兼性厌氧、可产

H2S

的海洋性细菌。

研究者根据

rRNA

序列分析，建议提出一个新的属，施万菌属被正式命名。目前施万菌属的成员已超过

70

个种。它们主要分布于海洋和淡水生境，也可分布于腐败的食物、水生有机质以及高盐、高压和低温等极端环境中。

H2S，氧化酶、明胶酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原反应均为阳性，可水解蔗糖、麦芽糖，亚硝酸盐还原反应、阴性，鸟氨酸脱羧酶反应为阳性。基因组的

含量为

。施万菌在含盐量为

1%-9%

小时后形成

培养基上呈现鲑鱼色。生长于血琼脂平板上的菌落也有产绿色色素的现象。S.algae）、腐败施万菌（S.putrefaciensS.xiamenensis）组织感染。施万菌引发感染的途径，包括职业性暴露()有施万菌的海洋生物()感染的风险。由于种间表型特征几乎相同，区分不同菌种的生化指标有限，很难应用于施万菌种的检测鉴定。使用的管家基因

rpoA

检测方法，和基于六个管家基因的施万菌种水平的

MLSA

鉴定方法。〕242）实验室中进行，采用B类（UN3373）包装运输。非感染性材料的实验操作在生物安全一级（BSL-1）实验室中进行。学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载附 录 B（规范性）设备和材料B.1

冰箱：4

℃~8

℃，

℃，

℃。B.2

恒温培养箱：

℃±1

℃。B.3

离心机：离心力

g。B.4

天平：感量

0.001

g。B.5

显微镜：

倍~

倍，有相差功能。B.6

培养皿：直径

90

或

60

。B.7

比色管或精密

试纸。B.8

震荡器。B.9

全自动微生物生化鉴定系统。B.10

飞行时间质谱仪。

微量移液器：量程

10

μL、200

μL

和

1000

μL。B.12

无菌刻度移液管：10

mL。B.13

无菌离心管：1.5

、15

和

50

mL。B.14

无菌吸头：10

μL、200

μL

和

1000

μL。B.15

PCR

管：0.2

。B.16

基因扩增仪。B.17

水平电泳仪：包括电源、电泳槽、胶槽和梳子。B.18

凝胶成像系统。ｚｆ．ｂｗｗ兔ｗ兔学ｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023ｚｆ．ｂｗｗ兔ｗ兔学ｘｗ．ｃｏｍ标准下载附 录 C（规范性）培养基和试剂C.1

施万菌增菌液蛋白胨 10.0

g氯化钠 30.0

g酵母粉 5.0

g去离子水 1000

将上述成分混合溶解后，校正

至

7.2±0.2，于

℃高压蒸汽灭菌

15

。C.2

硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂酵母粉 5.0

g蛋白胨 10.0

g硫代硫酸钠 10.0

g枸橼酸钠 10.0

g牛胆粉 5.0

g牛胆酸钠 3.0

g蔗糖 20.0

g氯化钠 10.0

g柠檬酸铁 1.0

g麝香草酚兰 0.04

g琼脂 15.0

g去离子水 1000

至

8.6±0.2

℃左右倾注平板备用。C.3

营养琼脂蛋白胨 10.0

g氯化钠 10.0

g牛肉膏 3.0

g琼脂 15.0

g去离子水 1000

将上述成分混合溶解后，校正

至

7.2±0.2，

℃高压蒸汽灭菌

。C.4

三糖铁琼脂（）蛋白胨 20.0

g．ｂｗｗ学兔兔ｗｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/CPMA

032—2023．ｂｗｗ学兔兔ｗｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载牛肉㓎膏 5.0

g氯化钠 5.0

g乳糖 10.0

g蔗糖 10.0

g葡萄糖 1.0

g酚红 0.025

g硫酸亚铁铵 0.2

g硫代硫酸钠 0.2

g琼脂 12.0

g去离子水 1000

除酚红和琼脂外，将其它成分加于

去离子水中，搅拌均匀，静置约

，加热使完全溶化，冷却至

左右校正

至

7.4±。另将琼脂加于

mL

去离子水中，静置约

10

，加热使完全溶化。将两液混合均匀，加入

5%

5

mL，混匀，分装小号试管，每管约

3

mL。于

121

高压蒸汽灭菌

或

115

高压蒸汽灭菌

，制成高层斜面，冷却后呈桔红色，放

2

8

条件下备用。C.5

氧化酶试剂二盐酸四甲基对苯二胺 1.0

g去离子水 100

mL称取

g

二盐酸四甲基对苯二胺，加入去离子水少许，充分振摇，待完全溶解后，加去离子水定容至

100

。冰箱内避光保存，在

7

天之内使用。C.6

5×

电泳缓冲液Tris

碱 54.0

g硼酸 27.5

gNa2EDTA·2HO 3.72

g去离子水 1000

将上述成分混合溶解，室温保存。琼脂糖凝胶电泳时使用浓度为

0.5×。105'→3'扩增序列长度(bp)gyrAgyrA-164FTGAAGAACGATTGGAACAA66456gyrA-827RgyrBUP-1125658UP-2rinfBinfB-1426F83056infB-2255RrecN-415F86354recN-1277RGGTTGTAAAGGTTGCCCTGGGTTrpoArpoA-83F75156rpoA-833RtopAtopA-70F86060topA-929R准ｏｍ标．ｃ学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ下载T/CPMA

032—2023准ｏｍ标．ｃ学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ下载附 录 D（规范性）施万菌种水平的鉴定（

法）D.1

核酸模板制备按照

8.6.1

进行操作。D.2

反应体系管家基因的上下游引物见表

D.1。PCR

反应体系按照

8.6.2

进行操作。表

D.1

施万菌

管家基因引物D.3

扩增条件94

预变性

10

，然后

94

s，~60

退火

30

s，表

D.1

施万菌

管家基因引物D.3

扩增条件环，最后

10

。对于上述

6

对管家基因，PCR

扩增的退火温度见表

D.1。D.4

扩增产物分析PCR

扩增结束后，取

5

μL

产物于

1%琼脂糖凝胶中，在

120

V

电压下电泳

45

，验证是否为单一条带并位于相应的片段大小位置上。剩余产物使用相应管家基因引物进行双向测序。D.5

MLSA

进化树将测序获得的实验菌株

、、、、

和

基因分别对应大肠杆菌

56-1455、247-744、、1519-2181、565-1200、139-756

和

106-768

的基因位点截齐，然后将六个管家基因序列按

-gyrB--recN-rpoA-topA

顺序依次串联。并以施万