TCDD对血管平滑肌细胞的影响及在血管内皮损伤修复中的作用

TCDD对血管平滑肌细胞的影响及在血管内皮损伤修复中的作用目前我国已步入老龄化社会,随着老年人口的增加,我国脑血管病的发生率也越来越高。数据显示脑血管病已成为国内致死致残首位病因,故对脑血管病的发生发展机制及影响因素等进行研究具有十分重要的意义。既往研究显示脑血管病的发生发展与血管损害因素及血管修复因素之间的失衡相关,炎症因素以及血流动力学被认为在其中发挥着重要的作用。近些年来,环境因素与疾病的关系也越来越受到重视。TCDD是一种危害极大的环境污染物,其分布广泛,来源多,毒性强,在大气及许多生物体内均被检测到。包括我国在内的很多国家都把控制TCDD排放摆在极其重要的位置。TCDD性质相对稳定,不易降解,会随着食物链在生物体内不断积聚。其对生物体内AhR具有强亲和力,主要通过激活AhR在免疫、炎症、毒理及癌症等方面发挥作用,已被发现和多种疾病的发生相关。但目前关于TCDD与脑血管病的关系研究不多。此前有研究显示烟草中的烟雾可通过AhR参与炎症反应并在动脉瘤及动脉粥样硬化等疾病中发挥作用。既往研究还显示,TCDD等环境污染物可在多种细胞中影响IL-1β产生,而IL-1β等炎性细胞因子被认为与动脉粥样硬化等心脑血管疾病的发生相关。我们推测TCDD可通过激活AhR对血管壁产生炎症反应影响血管壁损伤修复平衡从而对脑血管病的发生发展产生影响。本研究的主要目的有:1、通过两种不同小鼠颈动脉损伤模型研究TCDD对血管内皮损伤修复的影响;2、研究TCDD对血管平滑肌细胞的影响及进行相关机制研究。本研究涉及的主要技术方法有:两种不同小鼠颈动脉损伤模型的建模,标本取材固定包埋切片,HE及免疫组化染色,免疫荧光染色,实时定量PCR,贴壁细胞培养传代,血管平滑肌细胞表型转化模型建立,CCK8细胞活力检测,细胞迁移能力检测,酶联免疫吸附实验(ELISA),蛋白质免疫印迹实验(Westernblotting),医学统计等。第一部分TCDD对小鼠颈动脉导丝损伤模型内皮损伤修复的影响目的:1.检测TCDD对小鼠颈动脉导丝损伤模型内皮损伤修复的影响。2.检测新生内膜中主要细胞类型及其中IL-1β等表达情况。方法:1.TCDD急性给药:随机分为TCDD建模组、玉米油溶剂建模组、单纯建模组和假手术组。通过不同剂量TCDD提前腹腔注射,随后进行小鼠颈动脉导丝损伤模型的建立;2.TCDD慢性给药:分为1月组和2月组;每组又进一步随机分为TCDD建模组、玉米油溶剂建模组、单纯建模组和假手术组。其中TCDD建模组又分为0.1μg/kg,1μg/kg,10μg/kg三组不同剂量组。长期给药后进行小鼠颈动脉导丝损伤模型的建立;3.检测CH-223191对TCDD的拮抗作用:分为玉米油溶剂组、TCDD组及CH-223191+TCDD组。给药后三组均进行小鼠颈动脉导丝损伤模型的建立;4.所有组别均为建模2周后取颈动脉标本进行HE染色检测内膜增生情况,采用Image-proplus软件进行内膜/中膜面积分析计算;免疫组化及免疫荧光检测α-SMA、CD31、IL-1β等指标。5.QPCR检测颈动脉标本中IL-1β等mRNA表达差异。结果:1.该模型中导丝损伤致颈动脉内皮剥脱效果明确,模型成功。2.TCDD急性给药及不同剂量慢性给药均促进颈动脉导丝损伤模型诱导的内膜增生,同时慢性给药内膜增生情况与TCDD给药呈现剂量效应正比关系。3.TCDD促进颈动脉导丝损伤模型诱导的增生内膜中的IL-1β表达。4.TCDD拮抗剂CH-223191减弱TCDD诱导的颈动脉导丝损伤模型内膜增生作用。结论:1.TCDD促进颈动脉导丝损伤模型诱导的内膜增生,同时内膜增生情况与TCDD给药呈现剂量效应正比关系;2.内膜增生的主要成分是平滑肌细胞;3.TCDD可促进增生内膜中炎性因子IL-1β的表达增加,IL-1β可能与内膜过度增生相关;4.TCDD促进内膜增生的作用是AhR依赖性的。第二部分TCDD对小鼠颈动脉结扎模型内皮损伤修复的影响目的:1.检测TCDD对另一种机制不同的小鼠颈动脉结扎模型内膜增生的影响及增生内膜的主要细胞类型。2.检测增生内膜中IL-1β等表达情况。方法:1.提前腹腔注射给药后急性小鼠颈动脉结扎模型的建立;2.2周后取颈动脉标本进行HE染色检测内膜增生情况,采用Image-proplus软件进行内膜/中膜面积分析计算;免疫组化及免疫荧光检测α-SMA、CD31、IL-1β等指标。3.QPCR检测颈动脉标本中IL-1β等mRNA表达差异。结果:1.TCDD促进颈动脉结扎模型诱导的内膜增生;2.TCDD促进增生内膜中炎性因子IL-1β的表达增加,IL-1β可能与内膜过度增生相关;3.CH-223191减弱TCDD诱导的颈动脉结扎模型内膜增生作用。结论:TCDD促进颈动脉结扎模型诱导的内膜增生,血管平滑肌细胞是其中的主要成分,在其中起着重要作用;TCDD可促进增生内膜中炎性因子IL-1β的表达增加;TCDD促进内膜增生的作用是AhR依赖性的。第三部分TCDD对人脑血管平滑肌细胞的影响及机制研究目的:1、研究常见的4种血管平滑肌细胞表型转化刺激因子对人脑血管平滑肌细胞表型转化的影响;2、研究TCDD及IL-1β对人脑血管平滑肌细胞表型转化的影响及表型转化后增殖迁移等功能变化;3、研究TCDD对人脑血管平滑肌细胞IL-1β表达的影响;4、研究TCDD对IL-1β表达影响的机制。方法:1、分别以4种常用平滑肌表型转化刺激因子:PDGF-BB(20ng/ml)、IL-1β(40ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)及TGF-β(10ng/ml)对人脑血管平滑肌细胞进行刺激,检测其中α-SMA及calponin水平变化;2、分别以0.1nM、1nM和10nMTCDD对人脑血管平滑肌细胞进行刺激,检测其中α-SMA、calponin及IL-1β水平变化;3、选用1nMTCDD和40ng/mlIL-1β单独及共同对人脑血管平滑肌细胞进行刺激,检测血管平滑肌细胞增殖迁移能力的变化;4、检测CH-223191对TCDD的拮抗作用;5.检测TCDD对人脑血管平滑肌细胞分泌IL-1β的影响;6.检测TCDD对人脑血管平滑肌细胞NLRP3炎症小体等相关表达的影响,选用NF-κB抑制剂检测TCDD刺激后IL-1β的变化。结果:1.IL-1β可使人脑血管平滑肌细胞表型转化,表型转化后增殖迁移能力增强;2.TCDD可以促进人脑血管平滑肌细胞表型转化,同样促使血管平滑肌细胞IL-1β表达及分泌增高,NLRP3水平未随IL-1β发生变化。NF-κB抑制剂可抑制TCDD诱导的IL-1β的表达增加。结论:IL-1β介导人脑血管平滑肌细胞由分化状态向去分化状态的转化,表型转化后人脑血管平滑肌细胞增殖迁移能力增加,而TCDD可以促进人脑血管平滑肌细胞IL-1β表达的增加,其机制是通过AhR介导的,NF-κB信号通路参与了该过程,而整个IL-1β表达增加的过程中NLRP3炎症小体没有被激活。小结:1.TCDD可以促进小鼠颈动脉导丝损伤模型及颈动脉结扎模型内膜增