天然乳香香味剂3-羟基丁酮产生菌的构建及制备工艺的研究

天然乳香香味剂3-羟基丁酮产生菌的构建及制备工艺的研究3-羟基丁酮(又名乙偶姻、乙酰甲基甲醇、英文名acetoin),具有令人愉快的奶油香气,天然存在于某些植物中如玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、草莓等,以及动物组织中,是一种令人喜爱的食用香料,是国际上应用广泛的常用香料品种。3-羟基丁酮还是一种重要的C4平台化合物,2004年美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。3-羟基丁酮的生产方式包括化学合成法、酶法转化和微生物发酵法,目前,化学合成方法仍是3-羟基丁酮的主要生产方式,该方法存在着工艺复杂、生产成本高、环境污染严重等问题,也不符合天然、绿色、安全的消费理念,限制了其在食品、医药行业的应用前景;酶法转化由于高效生物酶获取困难限制了其工业化的应用;而微生物发酵法是以微生物为工具,利用可再生的生物质为原料,原料来源丰富、条件温和、环境友好、产品绿色安全,能从根本上改变化学合成法生产3-羟基丁酮所面临的资源与环境压力,是最具竞争力的生产方法。发酵法已成为3-羟基丁酮生产方法研究的热点。本研究利用随机诱变手段选育得到一株产3-羟基丁酮的高产突变株BacillussubtilisSF3-102,针对菌株遗传改造、3-羟基丁酮发酵工艺及下游工程等开展研究,论文的主要研究结果如下:(1)前期工作中,从自然界中分离筛选获得了一株产3-羟基丁酮B.subtilisSF4-3,采用了传统的诱变手段包括紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基胍对菌株进行随机处理,获得了一种3-羟基丁酮产量明显提高的突变株SF3-102;研究考察了环境条件和营养组分对菌株SF3-102代谢合成积累3-羟基丁酮的影响,其最适接种量为5%(v/v),最适培养温度为36-38℃,采用统计学手段对培养基组分的影响进行了考察,得到了最适的培养基组成:葡萄糖160g/L,酵母膏6.5g/L,玉米浆13g/L,尿素3g/L,MnSO40.05g/L,FeSO40.05g/L。在上述条件下菌株SF3-102摇瓶发酵3-羟基丁酮产量达到了60.64g/L。(2)为了解析菌株SF3-102积累3-羟基丁酮的代谢机理,本研究使用IlluminaSolexa技术对B.subtilisSF3-102进行全基因组鸟枪法denovo测序,拼装后最终得到10条scaffolds,共4,153,882bp的数据,共有4545个开放阅读框架,其平均长度为798bp,编码区域包含3,625,437bp,占基因组数量的87.28%,并进行了蛋白编码基因的GO(GeneOntology)注释、COG(ClusterofOrthologousGroupsofproteins)的注释以及KO及Pathway注释,在上述分析的基础上,针对与3-羟基丁酮代谢的相关基因,将该菌株与NCBI中已经测序的枯草芽孢杆菌菌株168和BEST195进行了比较基因组学分析,确定了枯草芽孢杆菌菌株过量积累3-羟基丁酮相关的关键基因或操纵子上个别氨基酸的基因突变位点。(3)结合菌株SF3-102的3-羟基丁酮代谢网络及全基因组测序的研究,对菌株进行了分子改造。2,3-丁二醇作为3-羟基丁酮生产过程中的主要的副产物,是有3-羟基丁酮在丁二醇脱氢酶(BDH)的作用下转化而成,它的存在对3-羟基丁酮的产率及下游分离提取均有影响,因此,为切断2,3-丁二醇的合成或减少其积累,对BDH编码基因bdhA进行了敲除。考虑到该菌株的工业应用性,选用了一种无痕“Cre/lox”基因敲除系统,得到一株bdhA基因敲除后的菌株B.subtilisSFAP,摇瓶发酵实验表明2,3-丁二醇的产量由21.5g/L降至6.1g/L,3-羟基丁酮的产量提升了23.6%,产量达69.5g/L,生产效率达0.97g/L/h。(4)采用5L和50L全自动发酵罐对菌株SFAP3-羟基丁酮发酵条件和控制进行了系统研究,重点考察了溶解氧(罐压、通风和搅拌)和pH对菌株3-羟基丁酮发酵的影响,确定了菌株SFAP生产3-羟基丁酮的具体控制策略和参数:发酵过程中控制溶解氧5-10%,以调控搅拌转速为主(400-500r/min),调节通风量为辅(1.0-1.2m3/h),前期菌体生长期,控制pH6.5-7.0,后期产物形成期,控制pH5.5-6.0。实验方案在1000L规模发酵罐上进行放大实验,平均发酵周期70.2h,3-羟基丁酮产率64.84g/L,转化率40.42%。5000L发酵罐生产性实验发酵周期平均68.3h,最高产率64.90g/L。采用1000L发酵罐研究了3-羟基丁酮补料发酵工艺,确定了最佳补料方式,发酵周期78h3-羟基丁酮最高产率78.9g/L。(5)针对生物法生产3-羟基丁酮的下游提取工艺进行了系统研究,确定了发酵液的预处理净化工艺。发酵液预处理采用陶瓷膜过滤,控制物料温度≤80℃,操作压力≤0.2MPa,膜面错流速度≤5m/s;研究确定了过膜清液的脱色工艺,优选确定了脱色效果较好的活性炭型号ZX-303,脱色温度50-55℃,活性炭添加量0.8-1.0%,脱色时间20-25min;重点研究了3-羟基丁酮的提取纯化工艺,比较研究了精馏、加盐精馏和萃取等分离技术在3-羟基丁酮分离纯