22.5亲和组织化学检验技术讲解

第二十二章

免疫组织化学检验技术知识目标1.掌握：免疫组化技术的定义、基本过程、抗原的修复方法（重难点），抗体的选择和保存；酶标记抗体的免疫组化染色（直接、间接法）的原理，荧光免疫组化标本类型和保存。2.熟悉：免疫组化标本来源、固定于保存，结果判断；非标记酶免疫组化的常见类型及原理、亲和组织化学技术的定义及分类（重点）。3.了解：常见亲和组织化学技术的原理、优缺点及应用。能力目标掌握抗原的修复方法，免疫组化标本的采集、固定于保存、结果判断。思政-素质目标责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维教学目标目录概述一免疫组化技术基本知识二酶免疫组织化学检验技术三荧光免疫组织化学检验技术四亲和组织化学检验技术五其他免疫组织化检验技术六亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合形成相应复合物，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、植物凝集素与糖类、SPA与IgG、链霉亲和素与生物素等。亲和组织化学检验技术五一、生物素-亲和素法生物素可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素也称抗生物素，每个亲和素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。常用的技术类型有：1.标记亲和素-生物素法（LAB法）将亲和素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，提高了检测抗原的敏感性。2.桥连亲和素-生物素法（BAB法）先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。3.亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物法（ABC法）此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶（辣根过氧化物酶）标生物素结合在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。

二、SPA法SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等的IgGFc结合的能力，这种结合不会影响抗体的活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。三、链霉亲和素—生物素技术链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就组成酶标链霉亲和素-生物素方法（LSAB）。

LSAB法的特点:①特异性强；②分子量小，穿透力强，放大效应远超ABC法，故其敏感性更强；③等电点中性更适合组织，可明显减少非特异性染色，低背景着色使特异性着色更清晰；④操作时间缩短，更简便。四、凝集素法一种凝集素具有专一性结合某种特异性糖基的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型并反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的变化。标记了相应示踪物的凝集素可用来：①作为细胞分化和成熟的标记②作为细胞特殊类型的标记③肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，也可用凝集素检测出肿瘤细胞。常用下列染色法：①直接法—标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合②间接法—将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上③糖—凝集素—糖法—