生物化学生物氧化试题及答案及生物化学实验

生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部

实验一酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。二、原理．牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。三、器材1、离心机2、．抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计．四、试剂与材料1、牛奶2500mL2、95％乙醇1200mL3、无水乙醚1200mL4、0.2mol／LpH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL5、．乙醇—乙醚混合液2000mL五、操作将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)，弃去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)得率：思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1.学习分光光度计的原理和使用方法。2.学习测定淀粉酶活力的方法。3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。三、器材1.25mL刻度试管2.吸管3.离心管4.乳钵5.分光光度计6.恒温水浴7.离心机四、试剂和材料1、小麦种子2、o.1％标准麦芽糖溶液精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。3.pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。4、1％淀粉溶液1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂将1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml2ML1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。6、1％氯化钠溶液五、实验操作1、种子发芽小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。2、酶液提取取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心（1500r/min）6—7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上）。3、酶活力测定（1）取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟）试管标号试剂1234干燥种子的酶提取液发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液标准管空白管酶液（mL）0.50.5——标准麦芽糖溶液（mL）——0.5—1％淀粉溶液（mL）1111水（mL）———0.5将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL。（2）取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温，加水稀释至25mL。并混匀。在A500nm处测定各管的吸光度。填入表中试管号干燥种子的酶提取液发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液标准管空白管A500nm吸光度4、计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，本实验规定：25℃时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（u）。酶活力计算公式为：式中：C酶酶液麦芽糖的浓度，V酶提取酶液的总体积，n酶酶液稀释倍数。思考题为什么此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？而测酶的活力时要在25预保温？反应后又放入沸水浴中？实验结果说明什么？实验三纸层析法分离鉴定氨基酸一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：…在一定的条件下某种物质的只Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材1.层析缸2.毛细管3.喷雾器4.培养皿5.层析滤纸(新华一号)四、试剂1、扩展剂650mL4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。2、氨基酸溶液0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5％)。各5mL3、显色剂50～100mL1％水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2.取层析滤纸(长22cm、宽14cm)一张。在纸的—端距边缘2～3cm处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。3.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。4.扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15—20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5.显色用喷雾器均匀喷上O.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。6.计算各种氨基酸的只Rf值。思考题1、何谓纸层析法?2、何谓片Rf值?影响Rf值的主要因素是什么?3、怎样制备扩展剂?层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验四酶的特性一、目的加深对酶的性质的认识。二、内容本实验由温度对酶活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专—性4组实验组成。(一)温度对酶活力的影响1、原理酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50～60℃。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性井无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2、器材(1)试管及试管架(2)恒温水浴(3)冰浴(4)沸水浴3、试剂和材料(1)0.2％淀粉的0.3％氯化钠溶液150mL需新鲜配制(2)稀释200倍的唾液50mL用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200倍(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)，混匀备用。(3)碘化钾—碘溶液50mL将碘化钾20g及碘l0g溶于100mL水中。使用前稀释10倍。4、操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后按下表加入试剂：管号123淀粉溶液(mL)1.51.51.5稀释唾液(mL)11—煮拂过的稀释唾液(mL)——1摇匀后，将1、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10分钟后取出(将2号管内液体分为两半)，用碘化钾—碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放人37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何?(二)pH对酶活性的影响1、原理酶的恬力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。2．器材(1)试管及试管架(2)吸管(3)滴管(4)50mL锥形瓶5)恒温水浴3、试剂和材料(1)新配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液250mL(2)稀释200倍的新鲜唾液100mL(3)0.2mol/L磷酸氢二钠溶液600mL(4)0.1mol/L柠檬酸溶液400Ml(5)碘化钾—碘溶液50mL(6)pH试纸pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四种4、操作取4个标有号码的50mL锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0～8.0的4种缓冲液。锥形瓶号码0.2mol／L磷酸氢二钠0.1mol/L柠檬酸pH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.720.288.0从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5％淀粉溶液2mL和稀释200倍的唾液2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。三)唾液淀粒酶的活化和抑制1、原理酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。2、器材(1)恒温水浴(2)试管及试管架3、试剂和材料(1)0.1％淀粉溶液150mL(2)稀释200倍的新鲜唾液150mL(3)1％氯化钠溶液50mL(4)1％硫酸铜溶液50mL(5)1％硫酸钠溶液50mL(6)碘化钾—碘溶液100mL4、操作管号12340.1％淀粉溶液(mL)1.51.51.51.5稀释唾液(mL)0.50.50.50.5l％硫酸铜溶液(mL)0.5———1％氯化钠溶掖(mL)—0.5——1％硫酸钠溶液(mL)——0.5—蒸馏水(mL)———0.537℃恒温水浴、保温10分钟碘化钾—碘溶液(滴)2～32～32～32～3现象解释结果；说明本实验第3管的意义。（四）酶的专一姓1.原理酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。2、器材．(1)恒温水浴(2)沸水浴(3)试管及试管架3、试剂和材料(1)2％蔗糖溶液150mL(2)溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液150mL需新鲜配制间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。(3)稀释200倍的新鲜唾液100mL(4)蔗糖酶溶液100mL将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2～3次(离心法)，然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。(5)Benedict氏试剂200mL无水硫酸铜17.4g溶于100mL热水中，冷却后稀释至150mL。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600mL水共热，溶解后冷却并加水至850mL。再将冷却的150mL硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。4、操作（1）淀粉酶的专一性管号1234561％淀粉溶液(滴)4—4—4—2%蔗糖溶液(滴)—4—4—4稀释唾液(mL)——11——煮沸过的稀释唾液(mL)————11蒸馏水(mL)11————37℃恒温水浴15分钟Benedict试剂(mL)111111沸水浴2—3分钟│现象解释实验结果(提示：唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶)。（2）蔗糖酶的专一性管号1234561％淀粉溶液(滴)4—4—4—2%蔗糖溶液(滴)—4—4—4蔗糖酶溶液(mL)——11——煮沸过的蔗糖酶溶液(mL)————11蒸馏水(mL)11————37℃恒温水浴15分钟Benedict试剂(mL)111111沸水浴2—3分钟│现象解释实验结果。思考题1、什么是酶的最适温度及其应用意义?2、什么是酶反应的最适pH?对酶活性有什么影响?3、什么是酶的活化剂?4、什么是酶的抑制剂?与变性剂有何区别?5、本实验结果如何证明酶的专一性?实验五菜花中核酸的分离和鉴定一、目的初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和RNA、DNA的定性检定。二、原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液(10％氯化钠溶液)和0.5mol／L高氯酸(70℃)分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。1、核糖的测定测定核糖的常用方法是苔黑酚(即3，5—二羟甲苯法)。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟甲苯在沸水浴中加热10—20分钟后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5—二羟甲苯作用产生绿色物质。DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。2．脱氧核糖的测定测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω—羟基—6—酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。100℃DNA+二苯胺试剂蓝色物此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。三、器材1．恒温水浴2．电炉3，离心机4．布氏漏斗装置5．吸管6．烧杯7．量筒8．剪刀四、试剂和材料1、新鲜菜花2、95％已醇600mL3、丙酮400mL4、5％高氯酸溶液200mL5、0.5mo1/L高氯酸溶液200mL6、10％氯化钠溶液400mL7、标准RNA溶液(5mg／l00mL)50mL8、标准DNA溶液(15mg／100mL)50mL9．粗氯化钠250g10．海砂5g11．二苯胺试剂60mL将1g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入2.75mL浓硫酸(置冰箱中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀)。12．三氯化铁浓盐酸溶液25mL13．苔黑酚乙醇溶液200mL1、核酸的分离(1)取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL95%乙醇和400mg海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。(2)滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。(3)再向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5分钟后抽干(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。(4)在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL5％高氯酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。(5)将滤渣悬浮于20mL95％乙醇中，抽滤，弃去滤液。(6)滤渣中加人20mL丙酮，搅拌5分钟，抽滤至于，用力压滤渣尽量除去丙酮。(7)将干燥的滤渣重新悬浮在40mL10％氯化钠溶液中。在沸水浴中加热15分钟。放置，冷却，抽滤，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。(8)将滤渣重新悬浮在20mL0.5mol／L高氯酸溶液中。加热到70℃、保温20分钟(恒温水浴)后抽滤，留滤液(提取物二)。·2．RNA，DNA的定性检定二苯胺反应管号12345蒸馏水(mL)1--------DNA溶液(mL)--1------RNA溶液(mL)----1----提取物一(mL)------1--摄取物二(mL)--------1二苯胺试剂（mL）22222放沸水浴中10分钟后的现象（2）苔黑酚反应管号12345蒸馏水(mL)1--------DNA溶液(mL)--1------RNA溶液(mL)----1----提取物一(mL)------1--摄取物二(mL)--------1三氯化铁浓盐酸溶液(mL)22222苔黑酚乙醇溶液(mL)0.20.20.20.20.2放沸水浴中10分钟后的现象思考题1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?本实验是怎样除掉的?2．实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合物?DNA产生蓝色物质?实验六紫外分光光度法测定核酸的含量一、目的1.了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2.学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波长处。一般在A260nm波长下，每mL含1µgDNA溶液的光吸收值约为0.020，每mL含1µgRNA溶液的光吸收值约为0.022。故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法预先除去。三、器材1.分析天平2.离心机3.容量瓶4.紫外分光光度计5.吸管6.冰浴或冰箱四、试剂1、5%～6%氨水2、钼酸铵—高氯酸试剂(沉淀剂)如配制200mL可在193mL蒸馏水中加入7mL70%高氯酸和0.5g钼酸铵。五、操作1.用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。然后用5%～6%氨水调至pH7，定容到50mL。2.取2支离心管，向第一支管内加人2mL样品溶液和2mL蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或冰箱中放置30分钟后离心(3000r／min，10分钟)。从第一管和第二管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。用光程为1cm的石英比色杯，于260mn波长处测其光吸收值(A1和A2)。六、计算如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～50µg/mL)在紫外分光光度计上直接测定。实验七总氮量的测定—凯氏定氮法目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。原理常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸）的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，此反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程表示如下：CHCH2NH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+NH32NH3+H2SO4—————（NH4）2SO4弄浓浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸留到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据使用的标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。三、仪器1.50mL消化管或100mL凯氏烧瓶2.改进型凯氏定氮仪3．50mL容量瓶4．3mL微量滴定管5．分析天平6．烘箱7．电炉8．1000mL蒸馏烧瓶9.小玻璃珠10．远红外消煮炉四、试剂1.消化液(过氧化氢：浓硫酸：水二3：2：1)200mL2．粉末硫酸钾—硫酸铜混合物16gK2S04与CuS04·5H20以3：1配比研磨混合。3．30％氢氧化钠溶液1000mL4．2％硼酸溶液500mL5．标准盐酸溶液(约0．01mol／L)600mL6．混合指示剂(田氏指示剂)50mL由50mL0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7．市售标准面粉和富强粉.各2g五、操作方法改进型凯氏定氮仪改进型凯氏定氮装置是在传统凯氏定氮装置的结构基础上改装而成，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。改进型凯氏蒸馏装置的结构如图所示。图改进型凯氏蒸馏装置1.水蒸汽发生器2.反应室3．水蒸汽排气孔4．排水排气孔5.外源水入口6．进样口7．加样漏斗8．冷凝器9．冷凝器出口10.自来水入口11．通气室出口13.通气室出口14．排水柱15．排水柱入口16．排水柱入口17.冷凝水和废水出口①②③自由夹可分成3部分来叙述：(1)水蒸汽发生器和反应室水蒸汽发生器有3个开口，3、4、5，反应室有1个开口，6。2)冷凝器和通气室冷凝器有2个开口，9、10，通气室有有2个开口，12、13(3)排水柱排水柱有3个开口，15、16、17。安装时，先将主体部分固定在支架上，其底部放上电炉。然后将5与13；4与16；12与15；6与7用橡皮管连接，并放上自由夹。最后长橡胶管连接进水口10和出水口172．样品处理某一固体样品中的含氮量是用l00g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(%)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。在称量瓶中称人一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重—次，直到两次称量数值不变，即达恒重。精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。3．消化取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各加1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04—CuS04·5H20)200mg，消化液5mL。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出S02白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾入50mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用。4，蒸馏(1)蒸馏器的洗涤接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)用电炉将其加热烧开。然后将蒸馏水由加样室加入反应室，水即自动吸出，或者将电炉移开片刻，或者打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗3—5次。清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5mL，12％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。蒸馏数分钟后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。(2)蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加入5mL12％硼酸溶液和1～2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。用移液管取5mL消化液，细心地由加样室下端加入反应室，随后将已准备好的30％NaOH溶液5mL加入，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。关闭自由夹打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约2—3分钟)，开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。打开自由夹，将水放出，再加热，再清洗，如此3—5次。最后将自由夹①、③同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后，继续下一次蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。(3)滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。(4)计算c为标准盐酸溶液摩尔浓度；v1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；v2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；w为样品重量(g)。14为氮的相对量子质量。若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，样品中蛋白质含量(％)=总氮量x6．25若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氟=总氮—非蛋白氮蛋白质含量(g%)=蛋白氮×6.25思考题1、何谓消化?如何判断消化终点?2、．在实验中加入粉末硫酸钾—硫酸铜混合物的作用是什么?3．固体样品为什么要烘干?4．蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中?5．如何证明蒸馏器洗涤干净?6．本实验应如何避免误差?实验八血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理二、原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120µm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。三、器材1．醋酸纤维薄膜(2×8cm)2．常压电泳仪3．点样器(市售或自制)4．培养皿(染色及漂洗用)5．粗滤纸6，玻璃板7．竹镊8．白磁反应板四、试剂1．巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.07)1000mL：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水1000mL。2．染色液300mL含氨基黑10B0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL(可重复使用)。3．漂洗液2000mL含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。4，透明液300mL含无水乙醇7份，冰醋酸3份。五、操作．浸泡用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。2．点样把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器先在放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3．电泳在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上(先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥(它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”)。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.4—0.7mA／cm(毫安／厘米)膜宽，电泳时间约为25分钟。酸纤维裹薄膜电泳装置示意图4．染色电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。5．漂洗将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。醋酸纤维薄膜血清蛋白电泳图谱从左至右，依次为：血清清蛋白α1，球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白，γ球蛋白定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放人透明液中浸泡2～3分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。思考题1．用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点?2．电泳图谱清晰的关键是什么?如何正确操作?【测试题】一、名词解释1.生物氧化

2.呼吸链

3.氧化磷酸化

4.P/O比值5.解偶联剂

6.高能化合物

7.细胞色素

8.混合功能氧化酶二、填空题9．琥珀酸呼吸链的组成成分有____、____、____、____、____。10．在NADH氧化呼吸链中，氧化磷酸化偶联部位分别是____、____、____，此三处释放的能量均超过____KJ。11．胞液中的NADH+H+通过____和____两种穿梭机制进入线粒体，并可进入____氧化呼吸链或____氧化呼吸链，可分别产生____分子ATP或____分子ATP。12．ATP生成的主要方式有____和____。13．体内可消除过氧化氢的酶有____、____和____。14．胞液中α-磷酸甘油脱氢酶的辅酶是____，线粒体中α-磷酸甘油脱氢酶的辅基是____。15．铁硫簇主要有____和____两种组成形式，通过其中的铁原子与铁硫蛋白中的____相连接。16．呼吸链中未参与形成复合体的两种游离成分是____和____。17．FMN或FAD作为递氢体，其发挥功能的结构是____。18．参与呼吸链构成的细胞色素有____、____、____、____、____、____。19．呼吸链中含有铜原子的细胞色素是____。20．构成呼吸链的四种复合体中，具有质子泵作用的是____、____、____。21．ATP合酶由____和____两部分组成，具有质子通道功能的是____，____具有催化生成ATP的作用。22．呼吸链抑制剂中，____、____、____可与复合体Ⅰ结合，____、____可抑制复合体Ⅲ，可抑制细胞色素c氧化酶的物质有____、____、____。23．因辅基不同，存在于胞液中SOD为____，存在于线粒体中的SOD为____，两者均可消除体内产生的____。24．微粒体中的氧化酶类主要有____和____。三、选择题Ａ型题25．氰化物中毒时被抑制的细胞色素是：A.细胞色素b560

B.细胞色素b566

C.细胞色素c1D.细胞色素c

E.细胞色素aa326．含有烟酰胺的物质是：A.FMN

B.FAD

C.泛醌

D.NAD+

E.CoA27．细胞色素aa3除含有铁以外，还含有：A.锌

B.锰

C.铜

D.镁

E.钾28．呼吸链存在于：A.细胞膜

B.线粒体外膜

C.线粒体内膜

D.微粒体

E.过氧化物酶体29．呼吸链中可被一氧化碳抑制的成分是：A.FAD

B.FMN

C.铁硫蛋白

D.细胞色素aa3

E.细胞色素c30．下列哪种物质不是NADH氧化呼吸链的组分？A.FMN

B.FAD

C.泛醌

D.铁硫蛋白

E.细胞色素c31．在氧化过程中可产生过氧化氢的酶是：A.SOD

B.琥珀酸脱氢酶

C.细胞色素aa3

D.苹果酸脱氢酶

E.加单氧酶32．哪种物质是解偶联剂？A.一氧化碳

B.氰化物

C.鱼藤酮

D.二硝基苯酚

E.硫化氰33．ATP生成的主要方式是：A.肌酸磷酸化

B.氧化磷酸化

C.糖的磷酸化D.底物水平磷酸化

E.有机酸脱羧34．呼吸链中细胞色素排列顺序是：A.b→c→c1→aa3→o2

B.c→b→c1→aa3→o2

C.c1→c→b→aa3→o2D.b→c1→c→aa3→o2

E.c→c1→b→aa3→o235．有关NADH哪项是错误的？A.可在胞液中形成

B.可在线粒体中形成

C.在胞液中氧化生成ATPD.在线粒体中氧化生成ATP

E.又称还原型辅酶Ⅰ36．下列哪种不是高能化合物？A.GTP

B.ATP

C.磷酸肌酸D.3-磷酸甘油醛

E.1,3-二磷酸甘油酸37．有关生物氧化哪项是错误的？A.在生物体内发生的氧化反应

B.生物氧化是一系列酶促反应C.氧化过程中能量逐步释放

D.线粒体中的生物氧化可伴有ATP生成E.与体外氧化结果相同，但释放的能量不同38．下列哪种物质脱下的氢不进入NADH呼吸链？A.异柠檬酸

B.β-羟丁酸

C.丙酮酸

D.脂酰辅酶A

E.谷氨酸39．由琥珀酸脱下的一对氢，经呼吸链氧化可产生：A.1分子ATP和1分子水

B.3分子ATP

C.3分子ATP和1分子水D.2分子ATP和1分子水

E.2分子ATP和2分子水40．1分子丙酮酸彻底氧化生成水和二氧化碳可产生几分子ATP？A.3

B.8

C.12

D.14

E.1541．呼吸链中不具质子泵功能的是：A.复合体Ⅰ

B.复合体Ⅱ

C.复合体Ⅲ

D.复合体Ⅳ

E.以上均不具有质子泵功能42．胞液中1分子乳酸彻底氧化可生成几分子ATP？A.9或12

B.11或12

C.13或14

D.15或16

E.17或1843．关于线粒体内膜外的H+浓度叙述正确的是：A.浓度高于线粒体内

B.浓度低于线粒体内

C.可自由进入线粒体D.进入线粒体需主动转运

E.进入线粒体需载体转运44．心肌细胞液中的NADH进入线粒体主要通过：A.α-磷酸甘油穿梭

B.肉碱穿梭

C.苹果酸—天冬氨酸穿梭D.丙氨酸－葡萄糖循环

E.柠檬酸－丙酮酸循环45．丙酮酸脱下的氢在哪个环节上进入呼吸链？A.泛醌

B.NADH－泛醌还原酶

C.复合体Ⅱ

D.细胞色素c氧化酶

E.以上均不是46．关于高能磷酸键叙述正确的是：A.实际上并不存在键能特别高的高能键

B.所有高能键都是高能磷酸键C.高能磷酸键只存在于ATP

D.高能磷酸键仅在呼吸链中偶联产生E.有ATP参与的反应都是不可逆的47．机体生命活动的能量直接供应者是：A.葡萄糖

B.蛋白质

C.乙酰辅酶A

D.ATP

E.脂肪48．下列哪种维生素参与构成呼吸链？A.维生素A

B.维生素B1

C.维生素B2

D.维生素C

E.维生素D49．参与呼吸链递电子的金属离子是：A.铁离子

B.钴离子

C.镁离子

D.锌离子

E.以上都不是50．关于单加氧酶哪项是不正确的？A.参与胆色素的生成

B.参与胆汁酸的生成

C.参与类固醇激素的生成D.参与生物转化

E.参与血红素的生成51．离体肝线粒体中加入氰化物和丙酮酸，其P/O比值是：A.

2

B.

3

C.

0

D.

1

E.

452离体肝线粒体中加入异戊巴比妥和琥珀酸，其P/O比值是：A.

0

B.

1

C.

2

D.

3

E.

453．离体线粒体中加入抗霉素A，细胞色素C1处于：A.氧化状态

B.还原状态

C.结合状态

D.游离状态

E.活化状态54．甲亢患者不会出现：A.耗氧增加

B.ATP生成增多

C.ATP分解减少

D.ATP分解增加

E.基础代谢率升高55．下列哪种物质不抑制呼吸链电子传递？A.二巯基丙醇

B.粉蝶霉素A

C.硫化氢

D.寡霉素

E.二硝基苯酚56．关于细胞色素哪项叙述是正确的？A.均为递氢体

B.均为递电子体

C.都可与一氧化碳结合并失去活性D.辅基均为血红素

E.只存在于线粒体57．只催化电子转移的酶类是：A.加单氧酶

B.加双氧酶

C.不需氧脱氢酶D.需氧脱氢酶

E.细胞色素与铁硫蛋白58．关于呼吸链哪项是错误的？A.呼吸链中的递氢体同时都是递电子体B.呼吸链中递电子体同时都是递氢体C.呼吸链各组分氧化还原电位由低到高

D.线粒体DNA突变可影响呼吸链功能E.抑制细胞色素aa3可抑制整个呼吸链59．不含血红素的蛋白质是：A.细胞色素P450

B.铁硫蛋白

C.肌红蛋白

D.过氧化物酶

E.过氧化氢酶60．已知NAD+/NADH+H+和CoQ/CoQH2的氧化还原电位分别是-0.32和0.04，试求一对氢由NADH传到CoQ时氧化磷酸化的能量利用率：A.30%

B.40%

C.44%

D.50%

E.68%61．下列哪种酶以氧为受氢体催化底物氧化生成水？A.丙酮酸脱氢酶

B.琥珀酸脱氢酶

C.SOD

D.黄嘌呤氧化酶

E.细胞色素C氧化酶62．下列哪种底物脱下的一对氢经呼吸链氧化生成水，其P/O比值约为3？A.琥珀酸

B.脂酰辅酶A

C.α-磷酸甘油

D.丙酮酸

E.以上均不是63．关于超氧化物歧化酶哪项是不正确的？A.可催化产生超氧离子

B.可消除超氧离子

C.含金属离子辅基D.可催化产生过氧化氢

E.存在于胞液和线粒体中Ｂ型题（64~67）

A.磷酸肌酸

B.CTP

C.UTP

D.TTP

E.GTP64．用于蛋白质合成的直接能源是：65．用于卵磷脂合成的直接能源是：66．用于糖原合成的直接能源是：67．高能磷酸键的贮存形式是：（68~74）

A.细胞色素aa3

B.细胞色素b560

C.细胞色素P450D.细胞色素c1

E.细胞色素c68．在线粒体中将电子传递给氧的是：69．在微粒体中将电子传递给氧的是：70．参与构成呼吸链复合体Ⅱ的是：71．参与构成呼吸链复合体Ⅳ的是：72．参与构成呼吸链复合体Ⅲ的是：73．与线粒体内膜结合不紧密易于分离的是：74．与单加氧酶功能有关的是：（75~79）

A.氰化物

B.抗霉素A

C.寡霉素

D.二硝基苯酚

E.异戊巴比妥75．可与ATP合酶结合的是：76．氧化磷酸化抑制剂是：77．氧化磷酸化解偶联剂是：78．细胞色素C氧化酶抑制剂是：79．可抑制呼吸链复合体Ⅰ，阻断电子传递的是：（80~84）A.异咯嗪环

B.尼克酰胺

C.苯醌结构D.铁硫簇

E.铁卟啉80．铁硫蛋白传递电子是由于其分子中含：81．细胞色素中含有：82．FMN发挥递氢体作用的结构是：83．NAD+发挥递氢体作用的结构是：84．辅酶Q属于递氢体是由于分子中含有：Ｘ型题85．下列属于高能化合物的是：A.乙酰辅酶A

B.ATP

C.磷酸肌酸D.磷酸二羟丙酮

E.磷酸烯醇式丙酮酸86．呼吸链中氧化磷酸化的偶联部位有：A.NAD+→泛醌

B.泛醌→细胞色素b

C.泛醌→细胞色素c

D.FAD→泛醌

E.细胞色素aa3→O287．关于细胞色素叙述正确的有：A.均以铁卟啉为辅基

B.铁卟啉中的铁离子的氧化还原是可逆的C.均为电子传递体

D.均可被氰化物抑制

E.均可为一氧化碳抑制88．能以NADP+为辅酶的酶是：A.琥珀酸脱氢酶

B.谷氨酸脱氢酶

C.6-磷酸葡萄糖脱氢酶D.苹果酸酶

E.丙酮酸脱氢酶89．丙酮酸在彻底氧化时生成二氧化碳的反应有：A.丙酮酸脱氢酶催化的反应

B.异柠檬酸脱氢酶催化的反应C.α-戊二酸脱氢酶催化的反应

D.琥珀酸脱氢酶催化的反应E.苹果酸脱氢酶催化的反应90．线粒体外生物氧化体系的特点有：A.氧化过程不伴有ATP生成

B.氧化过程伴有ATP生成C.与体内某些物质生物转化有关

D.仅存在于微粒体中E.仅存在于过氧化物酶体中91．下列哪些底物脱下的氢可被FAD接受？A.脂酰辅酶A

B.β-羟脂酰辅酶A

C.琥珀酸D.α-磷酸甘油

E.

3-磷酸甘油醛92．影响氧化磷酸化的因素有：A.寡霉素

B.二硝基苯酚

C.氰化物

D.ATP浓度

E.胰岛素93．细胞色素P450的作用有：A.传递电子

B.加氢

C.加单氧

D.加双氧

E.脱羧94．下列哪些物质脱下的氢可进入NADH氧化呼吸链？A.异柠檬酸

B.α-酮戊二酸

C.苹果酸

D.琥珀酸

E.丙酮酸95．关于ATP合酶下列哪些叙述是正确的？A.位于线粒体内膜，又称复合体Ⅴ

B.由F1和F0两部分组成C.F0是质子通道

D.生成ATP的催化部位在F1的β亚基上E.F1呈疏水性，嵌在线粒体内膜中96．关于辅酶Q哪些叙述是正确的？A.是一种水溶性化合物

B.其属醌类化合物

C.其可在线粒体内膜中迅速扩散

D.不参与呼吸链复合体E.是NADH呼吸链和琥珀酸呼吸链的交汇点四、问答题97．试比较生物氧化与体外物质氧化的异同。98．描述NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链的组成、排列顺序及氧化磷酸化的偶联部位。99．试计算NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链的能量利用率。100．试述影响氧化磷酸化的诸因素及其作用机制。101．试述体内的能量生成、贮存和利用【参考答案】一、名词解释1．物质在生物体内进行的氧化反应称生物氧化。2．代谢物脱下的氢通过多种酶与辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合为水，此过程与细胞呼吸有关故称呼吸链。3．代谢物脱下的氢经呼吸链传递给氧生成水，同时伴有ADP磷酸化为ATP，此过程称氧化磷酸化。4．物质氧化时每消耗1摩尔氧原子所消耗的无机磷的摩尔数，即生成ATP的摩尔数，此称P/O比值。5．使氧化与ATP磷酸化的偶联作用解除的化学物质称解偶联剂。6．化合物水解时释放的能量大于21KJ/mol，此类化合物称高能化合物。7．细胞色素是一类以铁卟啉为辅基的催化电子传递的酶类，有特殊的吸收光谱而呈现颜色。8．混合功能氧化酶又称加单氧酶，其催化一个氧原子加到底物分子上，另一个氧原子被氢还原为水。二、填空题9．复合体Ⅱ

泛醌

复合体Ⅲ

细胞色素c

复合体Ⅳ10．NADH→泛醌

泛醌→细胞色素c

细胞色素aa3→O2

30.511．α-磷酸甘油穿梭

苹果酸－天冬氨酸穿梭

琥珀酸

NADH

2

312．氧化磷酸化

底物水平磷酸化13．过氧化氢酶

过氧化物酶

谷胱甘肽过氧化物酶14．NAD+

FAD15．Fe2S2

Fe4S4

半胱氨酸残基的硫16．泛醌

细胞色素c17．异咯嗪环18．b560

b562

b566

c

c1

aa3

19．细胞色素aa320．复合体Ⅰ

复合体Ⅲ

复合体Ⅳ21．F0

F1

F0

F122．鱼藤酮

粉蝶霉素A

异戊巴比妥

抗霉素A

二巯基丙醇

一氧化碳

氰化物

硫化氢23．CuZn-SOD

Mn-SOD

超氧离子24．加单氧酶

加双氧酶三、选择题Ａ型题25.E