构巢曲霉钙信号系统相关蛋白AnPcpA和AnPefA的分子特征及功能研究

构巢曲霉钙信号系统相关蛋白AnPcpA和AnPefA的分子特征及功能研究众所周知,钙信号是真核生物十分保守的第二信使,也可以说是细胞生存与死亡的信号。钙信号系统几乎介导所有的生理活动,包括生长、发育、增殖、分泌、物质运输以及逆境响应等。虽然已经证实真菌中存在着很多重要的钙信号系统成员如钙离子通道、钙调素、钙调磷酸酶等,已知它们在真菌发育、对抗逆境等起着十分重要的作用。但是,对于真菌钙信号系统的互作蛋白、下游靶标以及调控网络仍然知之甚少,更不清楚它们是如何参与真菌对于药物逆境的耐受性。曲霉(Aspergillus)是自然界中分布极为广泛的一大类真菌,它们包含了模式真菌---构巢曲霉(A.nidulans)、工业生产上使用的米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger),也包括与侵袭性曲霉感染相关的烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、土曲霉(A.terreus)等。构巢曲霉具有结构简单、遗传背景清楚、可以有性杂交等优势,因此是用来研究很多基础生物学问题的模式生物;同时它又是条件致病菌,也可以用来研究医学生物学问题。本课题以构巢曲霉为研究材料,应用生物信息学方法找到两个钙信号系统候选蛋白AnPcpA和AnPefA。通过应用融合PCR技术对基因进行定点敲除,荧光蛋白标记技术和启动子替换等技术研究它们的生物学功能。发现这两个候选蛋白在构巢曲霉极性生长,胞质分裂,逆境响应等重要生命活动中发挥重要作用。生物信息学分析表明构巢曲霉AnPcpA具有钙信号系统核心蛋白钙调素的结合域,因此我们推测AnPcpA可能和钙信号系统相关。我们的研究发现,AnPcpA是必需基因,参与构巢曲霉孢子萌发和菌丝生长发育过程。使用绿色荧光蛋白标记AnPcpA,发现GFP-AnPcpA聚集成点状定位在细胞核位置,并且CaM要大量聚集在菌丝生长顶端依赖AnPcpA发挥功能。另外,通过调控乙醇脱氢酶启动子抑制AnPcpA表达导致细胞极性生长丢失极为严重,细胞核重新分布。最有趣的现象是,成熟菌丝缺失AnPcpA功能后细胞形状和细胞骨架发生重塑,并且伴随着菌丝肿胀部位堆积大量细胞核,菌丝变细部位没有细胞核。进一步跟踪细胞核出现重排的原因,发现原来是AnPcpA功能缺失导致细胞微管组织成核受损,这也表明AnPcpA通过影响微管组织来影响细胞核锚定。本论文首次在丝状真菌活细胞中揭示了AnPcpA的生物学功能。AnPefA是生物信息学预测和钙信号相关的一个蛋白,它含有多个钙离子结合位点和EF-hand结构。由于哺乳动物研究成果表明AnPefA表达水平影响抗癌药物的药效,因此我们推测AnPefA可能参与钙信号系统调控曲霉对逆境的响应。我们的研究发现AnPefA参与曲霉耐药现象。使用荧光蛋白标记AnPefA,发现GFP-AnPefA分布在活细胞的整个细胞质中。缺失AnPefA基因导致构巢曲霉对伊曲康唑耐受,并且耐受程度依赖钙调磷酸酶。AnPefA基因缺失提高了曲霉在ITZ环境下的存活率。更有趣的是,缺失了AnPefA的细胞后在伊曲康唑环境下凋亡率减少,反之提高AnPefA表达使得细胞凋亡率升高。另外发现,细胞缺失AnPefA功能后细胞膜组分麦角固醇含量增高,而细胞药物外排泵的活力没有改变。我们的数据表明AnPefA通过影响细胞存活率和麦角固醇合成量从而影响曲霉对药物的耐受力。本论文首次揭示AnPefA在曲霉耐药现象中的生物学功能。综上所述,本论文首次具体描述了AnPcpA和AnPefA在曲霉极性生长,胞质分裂,逆境响应等重要生命活动中发挥的作用,这不仅为钙信