高中生物第五章第二节多聚酶链式反应扩增NDA片段1新人教版选修1

关于高中生物第五章第二节多聚酶链式反应扩增NDA片段1新人教版选修1★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术,1993年诺贝尔奖基础知识第2页,共30页，2024年2月25日，星期天㈠.DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第3页,共30页，2024年2月25日，星期天通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键第4页,共30页，2024年2月25日，星期天4.DNA分子的双螺旋结构⑴DNA分子是由

的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。⑵

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。⑶两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与

配对，

一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤第5页,共30页，2024年2月25日，星期天㈡.DNA的复制2.时期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期。3.场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。1.概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。4.基本条件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链第6页,共30页，2024年2月25日，星期天⑴.边解旋边复制(过程）5.复制特点⑵.半保留复制（结果）6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因8.复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行第7页,共30页，2024年2月25日，星期天小结：胞内DNA复制的基本知识使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸引物提供能量ATP催化合成DNA子链DNA聚合酶合成子链的原料4种脱氧核苷酸提供DNA复制的模板DNA母链打开DNA双链解旋酶在DNA复制中的作用参与的成分第8页,共30页，2024年2月25日，星期天㈢.PCR(多聚酶链式反应）2.TaqDNA聚合酶特性

高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化不能从头合成DNA，只能从DNA母链的的3′端开始延伸DNA链，或者总是从子链的5′端向3′端延伸因此，DNA复制需要引物。1.定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。第9页,共30页，2024年2月25日，星期天第10页,共30页，2024年2月25日，星期天3.PCR原理⑴在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。⑵当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。⑶PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。第11页,共30页，2024年2月25日，星期天4.需要为PCR反应提供的物质缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。5.PCR技术的特点：第12页,共30页，2024年2月25日，星期天6.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制PCR模板(母链)细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入原料:dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内的环境缓冲液第13页,共30页，2024年2月25日，星期天⑴PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸7.细胞内复制和PCR不同点⑵PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的8.PCR的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。第14页,共30页，2024年2月25日，星期天1、PCR仪㈠.设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。实验操作第15页,共30页，2024年2月25日，星期天2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。第16页,共30页，2024年2月25日，星期天1.准备2.移液㈡.实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。3.混合⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4.离心⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。第17页,共30页，2024年2月25日，星期天将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。5.反应循环数变性复性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.第18页,共30页，2024年2月25日，星期天⑴.变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。⑵.复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。⑶.延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。第19页,共30页，2024年2月25日，星期天模板链模板链PCR循环第一步：高温变性第20页,共30页，2024年2月25日，星期天模板链模板链引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火第21页,共30页，2024年2月25日，星期天模板链模板链引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸第22页,共30页，2024年2月25日，星期天模板链模板链第1个PCR循环完成后：得到两个靶序列第23页,共30页，2024年2月25日，星期天PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6.注意事项⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头第24页,共30页，2024年2月25日，星期天㈠.理论上DNA扩增数目的计算课题成果评价1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n㈡.实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。第25页,共30页，2024年2月25日，星期天⑵对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值⑶计算DNA含量(g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：1g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.022.过程⑴稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.第26页,共30页，2024年2月25日，星期天光吸收波长／nm2602402202800.10.2第