高三二轮复习生物新教材选择性必修3复习增分必背考点梳理（记忆版）

第一章发酵工程第1节传统发酵技术的应用一、发酵与传统发酵技术（P4）1．发酵的历史：约9000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、水果等发酵成含酒精的饮料。（P5）2.1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。（P5)3.腐乳的发酵参与发酵的微生物：多种微生物，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。（P5)4.腐乳的发酵发酵原理：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸,味道鲜美，易于消化吸收。（P5）5.发酵的概念：人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。（P5）6.发酵原理：不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力，因此利用它们既可以生产出人们所需要的多种产物。（P5）7.传统发酵技术的概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。（P5）8.使用酵母制作馒头属于传统发酵技术吗？不属于，使用前一次发酵保存下来的面团进行的才算；例如直接利用空气中毛霉孢子制作腐乳属于传统发酵技术，若直接接种毛霉，则不属于。（P5）9.传统发酵技术的特点:以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。（P5）10.传统发酵技术的主要食品:有腐乳、酱、酱油、醋、泡菜和豆豉。二、尝试制作传统发酵食品（P5）1．乳酸发酵微生物乳酸菌的特点：厌氧细菌，原核生物，以二分裂方式增殖，代谢类型为异养厌氧型，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，反应简式：C6H12O6eq\o(→,\s\up15(酶))2C3H6O3(乳酸)＋能量。（P5）2.乳酸发酵的生产应用：用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。（P5）3.乳酸菌的分布空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内。（P5）4.常见的乳酸类型乳酸链球菌和乳酸杆菌。（P6）5.酒精发酵微生物酵母菌的特点：单细胞真菌，真核生物，兼性厌氧微生物，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源。，在无氧条件下能进行酒精发酵，发酵原理（反应简式）为C6H12O6eq\o(→,\s\up15(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。温度是影响酵母菌生长的重要因素；酿酒酵母的最适生长温度约为为28℃。（P6）6.酒精发酵生产应用：用于酿酒、制作馒头和面包等。（P7）7.醋酸发酵微生物—醋酸菌的代谢特点：好氧细菌，代谢类型为异养需氧型，当O2、糖源都充足时能将糖分解成醋酸，反应简式为C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up15(酶))2CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反应简式为C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up15(酶))CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量。最适生长温度为30～35_℃。（P7）8.醋酸发酵生产应用：用于制作各种风味的醋。（P6）9.制作泡菜发酵原理:①利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵；②发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量百分比为0.4%0.8%时，泡菜的口味、品质最佳。（2）制作泡菜发酵条件:适宜的温度、严格控制厌氧条件。（3）制作泡菜方法步骤:配制盐水→蔬菜装坛→加盐水→封坛发酵①配制盐水:用清水和食盐配制质量百分比为5%~20%的盐水,并将盐水煮沸,冷却待用。②蔬菜装坛:将新鲜蔬菜洗净,切成块状或条状,混合均匀,晾干后装坛,装至半坛时,放入蒜瓣、生姜、及ITA香辛料,继续装至八成满。③加盐水:将冷却好的盐水缓缓倒入坛中,使盐水没过全部菜料。④封坛发酵:盖好坛盖,向坛盖边沿的水槽中注满水,发酵过程中注意补充水,根据室内温度控制发酵时间。制作泡菜实验分析①盐的作用：调味，抑制其他微生物生长及调味。②盐水浓度为质量百分比为5%20%。盐水浓度要适宜的原因：盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳酸菌死亡；过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。③盐水煮沸的目的：杀菌，去除水中的溶解氧。④盐水冷却后使用的目的：为了不影响乳酸菌的生命活动（为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响）。⑤在冷却后的盐水中可加入少量“陈菜泡液”，目的是增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间。⑥泡菜坛子使用之前要检查密封性的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件，利于乳酸菌发酵。⑦用水密封泡菜坛的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件。⑧泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用？不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌。（4）蔬菜应新鲜的原因：若不新鲜，蔬菜中的亚硝酸盐含量会升高。（5）泡菜坛应装至八成满？为什么？防止由于产生CO2而导致发酵液溢出坛外（初期大肠杆菌、酵母菌会产生）防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂。（6）为什么含有抗生素的牛奶不易发酵为酸奶？牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。（7）发酵中期时，由于前期乳酸的积累，pH下降，嫌气状态形成，乳酸杆菌进行活跃的同型乳酸发酵（发酵产物只有乳酸或达到80%以上），大肠杆菌、酵母菌等微生物的活动受到抑制。试分析这种微生物消长现象的原因（为什么乳酸菌会逐渐成为优势菌种）：乳酸菌比其他种类微生物更耐酸；发酵中期pH下降，导致其他种类的微生物的生命活动受到抑制。（8）说出乳酸发酵过程中下列变化乳酸菌数量变化先增多后减少；乳酸含量变化持续增多，最后保持稳定；亚硝酸盐含量变化先增多后减少，最后保持稳定。（9）泡菜制作过程中，各阶段菌种变化：①发酵初期：主要是大肠杆菌、酵母菌活跃，消耗大量氧气，使坛内形成无氧环境，会使好氧菌生命活动逐渐被抑制。②发酵中期（风味最佳）：乳酸菌活跃使乳酸不断积累，pH下降，会使不耐酸菌被抑制。③发酵后期：乳酸继续增加，到一定程度后会使乳酸菌的生长繁殖被抑制。（10）泡菜坛的发酵液表面会长出一层白膜，这层白膜是乳酸菌吗？不是，是酵母菌繁殖形成的，因为表面氧气含量丰富，不适于乳酸菌生长。（P6）（11）进一步探究——亚硝酸盐：泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生；膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡；亚硝酸盐为强氧化剂，能够把血液中的低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而导致缺氧性中毒症状；膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”形式随尿排出，只有在特定的条件下(如适宜的pH、温度和一定的微生物作用)，才会转变成致癌物──亚硝胺。（霉变的食品亚硝胺可增至数十倍至数百倍）。（P8）（12）拓展应用：某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加人一些“陈泡菜水”；在用质量百分比为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。请你帮他分析相关问题。①据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适?为什么?应该在11天后食用比较合适；因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平。②他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么?可能是食盐浓度过高，抑制乳酸菌生长，产生乳酸较少，导致泡菜未能正常发酵（也可能是由于温度较低）。③加入“陈泡菜水”的目的是什么？“陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌。④泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素哪些？腌制方法、食盐用量、腌制时间长短、温度高低。泡菜中亚硝酸盐的含量与腌制时间、腌制温度和有关。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，易造成细菌大量繁殖，使亚硝酸盐含量增加。（P7）10.制作果酒发酵原理：(1)许多新鲜水果的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌；(2)在酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒；（通过有氧呼吸大量繁殖，通过无氧呼吸进行酒精发酵产酒精）(3)相关反应式C6H12O6＋6O2＋6HO2eq\o(→,\s\up15(酶))6CO2＋12HO2＋能量C6H12O6eq\o(→,\s\up15(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量（P7）11.制作果酒发酵条件：(1)温度——将温度控制在1830℃进行发酵；(2)氧气含量a.氧气充足的情况下，大量繁殖；b.无氧条件下，进行酒精发酵.（P7）12.制作果酒方法步骤:器具消毒→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵①器具消毒:将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净,用体积分数为70%的酒精消毒,晾干备用。②冲洗:新鲜葡萄用清水冲洗1~2次,再去除枝梗和腐烂的的籽粒,沥干。③榨汁:用榨汁机榨取葡萄汁,装人发酵瓶中,留大约1/3的空间,盖好瓶盖。④酒精发酵:温度控制在18~30℃,每隔12h左右将瓶盖拧松一次,但不要打开瓶盖。发酵时间为10~12d。⑤醋酸发酵:葡萄酒制作完成后,打开瓶盖,盖上一层纱布,进行葡萄醋发酵,温度为30~35℃,时间为7~8d。13.制作果酒实验分析:(1)用体积分数为70%的酒精给发酵瓶、榨汁机消毒。(2)冲洗葡萄的目的：去除表面灰尘、污物。(3)冲洗12次即可，能否连续冲洗？为什么？不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少。(4)去梗之前冲洗还是去梗之后冲洗？之前。为什么？避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会。(5)葡萄汁装入发酵瓶时，能装满吗？不能，要留约1/3的空间。为什么？a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵；b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。(6)每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的：排出气体（CO2）。(7)能全部打开吗？不能为什么？防止杂菌污染。(8)果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。(9)在制作果酒过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？还有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能将糖分解为甘油、酒石酸等，从而使果酒变质，而在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇转化为乙醛进而转化为醋酸。可以通过调节发酵的温度、pH等来控制乳酸菌含量；可以通过减少O2含量、调节发酵温度、pH来控制醋酸菌含量。（10）如何检测果酒的发酵情况:闻、品尝、用酸性重铬酸钾溶液检测（橙色→灰绿色）。（11）葡萄酒呈现深红色的原因：在发酵过程中，红葡萄皮的色素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红色。（12）果酒制作中，酒精含量达一定程度后不变，CO2也不产生，原因可能是原料耗尽或高浓度的酒精抑制了酵母菌细胞呼吸。14.制作果醋参与发酵的主要微生物及来源：空气中的醋酸菌。15.制作果醋的发酵原理：（1）在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用可以进一步发酵成果醋；（2）当糖源、氧气充足时，醋酸菌还可以直接将糖分解为醋酸；（3）相关反应式：C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up15(酶))CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up15(酶))2CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量16.制作果醋的发酵条件：（1）温度——发酵温度为3035℃。（2）氧气含量——氧气供应充足。17.制作果醋的步骤：果酒制作→打开瓶盖，盖上纱布→果醋检测18.制作果醋的实验分析（1）在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低，不会继续发酵。（2）醋酸菌从何而来？打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入果酒发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件（不能利用乙醇）而不能繁殖。（3）采用什么措施可以加快果醋的制作？在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌；或者买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜（即醋酸菌膜），用这层薄膜进行接种亦可。（4）在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？a.在葡萄酒的制作过程中，发酵液会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生了CO2；b.开始发酵后，CO2产生越来越多，会使发酵液出现“沸腾”现象，在发酵的10天后，这种现象最明显；c.发酵过程产热，会使发酵液温度上升，应注意控温；d.发酵过程中，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色；e.果醋发酵完成后，发酵液的液面上会出现一层菌膜，即醋酸菌膜。（5）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止发酵液被污染？a.发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用；b.处理葡萄时应先冲洗再去除枝梗；c.排气时只需拧松瓶盖，不要打开瓶盖。（6）如何检测果醋的发酵情况？闻、品尝、使用pH试纸检测检测和比较发酵前后的pH值、观察醋酸菌膜是否形成。19.果酒和果醋制作的发酵装置（见右图）（1）充气口：在酒精发酵时应关闭；在醋酸发酵时连接充气泵泵入无菌空气。（2）排气口：酒精发酵时排出酵母菌产生的CO2；醋酸发酵时排出剩余的空气、CO2。（3）出料口：取样、监测。（4）排气口连接长而弯曲的胶管目的是防止空气中微生物的污染。1.酒精发酵时一般将温度控制在

18~30°C。(√)2.葡简酒酿造过程中需加入红色素，使葡萄酒呈深红色。(x)

3.在葡简酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。(√)

4.当缺少糖源，但氧气充足时，醋酸菌将乙醛变为乙醇，再将乙醇变为乙酸。(x)

5.醋酸菌是一

种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动，但短时间的缺氧，不会导致其死亡。(x)

6.在用带盖的瓶子制葡萄酒过程中，每隔12h左右，将瓶盖打开一次，

以放出CO2。(x）

7.葡萄酒发酵时，将葡萄汁装人发酵瓶要留有的空间。(√)

8.在碱性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。(x)

9.膳食中的亚硝酸盐不会危害人体健康。(x)

10.在泡菜的腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。(√)

11.参与腐乳制作的微生物只有毛霉，毛霉是一种丝状真菌。

(x)

12.制作泡菜时清水和食盐配制质量分数为5%~

20%盐水，煮沸后立即使用。(x)

13.在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种。(√)

14.分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤.沉淀等方法。(√)

15.在连续培养过程中补充的同种培养液和空气领先灭菌。(√)

16.乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产。(x）

17.发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关。(√)

18.单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的。(x)

第1章发酵工程第2节微生物的培养技术及应用一、微生物的基本培养技术1.防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提（即发酵工程的重要基础）。2.在实验室培养微生物：一方面：为微生物提供合适的营养和环境条件（培养基）。另一方面：要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来（无菌技术）。（一）培养基的配制1．培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2.培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。3．培养基的分类（按照物理性质分类）（1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态。用途：扩大培养获得大量菌种、常用于工业生产。目的是增加目的菌的数量。（2）固体培养基：含凝固剂（如琼脂），呈固体状态。用途：分离、计数、鉴定等。4.如何将液体培养基制成固体培养基？加入适量琼脂。5.微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。6.实验室中最常用的培养基之一：琼脂固体培养基。7.微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长，可以形成菌落。8.培养基的基本成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。如培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌(真菌)时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。9.牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，蛋白胨提供的主要营养为氮源、维生素。牛肉膏提供的主要营养为碳源、磷酸盐、维生素。10.为什么培养基需要氮源？培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。11.含C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。12.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。13.能否根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型？可以，例如自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源。14.无机氮源能给自养型微生物提供能源吗？可以，例如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。15.无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，还能有什么功能？有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）有些无机盐离子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）16.是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源？不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。（二）无菌技术1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。无菌技术应围绕如何避免杂菌的污染展开。无菌技术主要包括消毒和灭菌。2.无菌技术（消毒和灭菌）工作主要包括两个方面：(1)对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。常用的消毒方法有：煮沸消毒、巴氏消毒。(2)对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。灭菌的方法有：湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌。3.做好消毒灭菌工作后，要注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。4.为避免周围环境中微生物的污染，应如何操作？在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。5.无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。6.消毒:(1)概念：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。(2)方法:a.日常生活中经常用到煮沸消毒法，操作方法：100℃煮沸5～6min；b.对于一些不耐高温的液体如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s1min；c.生物活体、水源等还可使用化学药物进行消毒，操作方法：用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等；d.接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射，操作方法：紫外线照射30min。7.灭菌:（1）概念：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（2）方法:a.培养基等一般用湿热灭菌法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，操作方法：高压蒸汽灭菌锅内,100kPa，温度121℃,15～30min。b.耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)、金属用具等，可以用干热灭菌法，操作方法：物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h。c.接种过程中，微生物的接种工具、试管口、瓶口通过灼烧灭菌法来灭菌，操作方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。8.使用高压蒸汽灭菌锅时，能不能直接密封升温？不能，一定要将锅内冷空气彻底排出，才能密封升温，否则，可能引起锅内压力达到设定值而温度不能达到要求。9.高压蒸汽灭菌锅灭菌完毕后，可以立刻放气减压吗？不能，若立即放气减压瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢，甚至导致容器爆裂（须待灭菌锅内压力降至与大气压相等后才可打开排气阀开盖）。10.酒精消毒的最适范围是体积分数为70%75%的酒精。原因：酒精浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，从而凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中，酒精浓度过低时，杀菌能力减弱。11.用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果？照射前，适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。12.高压蒸汽灭菌使用的仪器为高压蒸汽灭菌锅，以水蒸气为介质，灭菌条件为压力200kPa、温度121℃、时间1530min。13.干热灭菌法使用的仪器为干热灭菌箱，以热空气为介质，灭菌条件为温度160170℃、时间23h。14.灼烧灭菌是将需灭菌的用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，优点是可以迅速彻底地灭菌。15.培养基的灭菌方法高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）；培养皿的灭菌方法干热灭菌（也可用湿热灭菌法）。（三）微生物的纯培养1．纯培养概念：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。2.纯培养物概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。3.获得纯培养物的过程就是纯培养。4.微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。5.微生物纯培养的原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。6.酵母菌的纯培养:用马铃薯琼脂培养基培养酵母菌。菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。一个单菌落即一个种群。菌落通常可以用来作为鉴定菌种的重要依据。获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。(2)酵母菌的纯培养:制备培养基、接种和分离酵母菌、培养酵母菌。制备培养基的步骤：配制培养基→灭菌→倒平板。①配制培养基：称取去皮的马铃薯200g,切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、1520g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。②将50ml培养基用玻棒转移至锥形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。③倒平板时使培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。a.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，温度过高，太烫，不易操作；若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。b.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？因为酒精灯火焰附近存在着无菌区域,避免避免周围环境中微生物的污染。拔掉瓶塞后为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。c.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？不能。为什么？因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。d.倒平板时，能将培养皿的皿盖拿下来放在一边吗？不能。应如何做？用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙。为什么？防止杂菌污染培养基。f.刚倒完平板，可以直接倒置吗？不能，应等培养基冷却凝固。g.培养基冷凝后，为什么要将培养皿倒过来放置（倒置）？既可防止皿盖上冷凝的水滴滴人培养基造成污染;又可避免培养基表面的水分过快蒸发。接种和分离酵母菌:①通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作将聚集的菌种逐步稀释分散到培养及表面。经数次划线后培养，可以分离得到单个菌落。②平板划线法接种、划线的工具接种环。③连续划线的目的：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。④平板划线法过程中，接种环蘸了1次菌液；若分五个区划线，则接种环共需灼烧6次；灼烧次数＝划线次数＋1。⑤灼烧后的接种环可以直接划线吗？不可以。应如何操作？待接种环冷却后再划线。目的？避免温度过高杀死菌种。⑥从第二次划线开始，都应从上一次划线的末端开始往下一区域划线。⑦整个操作中灼烧接种环的不同目的：第一次灼烧（取菌种前）：杀死接种环上原有微生物，避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。以后每次划线前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。划线结束灼烧：及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。⑧除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经数次划线后培养，可以分离得到单菌落（使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落）。⑨为什么划线时要注意不能划破培养基？a.一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；b.存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。=10\*GB3⑩用平板划线法接种划线某个平板培养后，第一区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他环线有菌落。造成划线无菌落的原因：a.接种环未冷却。b.划线未从第一区域末端开始划线（第二区域的第一条线未接到第一区域末端）。培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板（一般做三组，目的：平行重复实验）和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养2448h。7.如何确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底(该操作也可确定培养基灭菌是否彻底）。8.未接种的培养基直接培养起什么作用？做空白对照，判断培养基是否被污染，判断培养基灭菌是否彻底；若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。9.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。10.注意：（1）在实验室中，切不可饮食，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染；（2）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。二、微生物的选择培养和计数（一）选择培养基1.寻找耐高温DNA聚合酶的思路是什么？根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2．水生栖热菌的筛选：水生栖热菌能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。3.从环境中获得某种特定种类的微生物的原理：某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，就可以从特定的环境中筛选得到特定种类的微生物。（1）在被石油污染的土壤中可以筛选石油分解微生物。（2）在冰川冻土层可以筛选耐寒微生物。（3）漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？不是。4.实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。5．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。6.选择培养基三种筛选方法：（1）利用营养缺陷进行选择培养。某种营养缺陷的微生物不能正常生长（2）利用添加某种化学物质进行选择培养。*添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡（3）利用改变培养条件进行选择培养。*调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长7.选择培养基实例（1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长。原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用。配制：使用加入青霉素的培养基。（2）目的：分离固氮菌。原理：固氮微生物能利用空气中的氮气。配制：使用不加氮源（以N2为氮源）的培养基。（3）目的：分离自养型微生物。原理：自养型微生物能利用无机碳源。配制：使用不加有机碳源（以CO2为碳源）的培养基。（4）目的：分离耐酸菌。原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长。配制：使用将pH调至酸性的培养基。8.选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或对其某一化学、物理因素的抗性不同而制备选择培养基。9.如何设计培养基筛选分解尿素的细菌？以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。10.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。11.在选择培养基上生长的一定是所选择的目的菌吗？不一定，有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。12.怎么证明一个选择培养基具有选择性？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。13.尿素可为尿素分解菌提供氮源的原因？尿素可为尿素分解菌提供碳源吗？为什么？尿素分解菌能合成脲酶，脲酶能催化分解尿素产生NH3和CO2，NH3可作为尿素分解菌的氮源。但不能作为碳源，因为尿素分解菌不是自养生物，不能利用CO2作为氮源。（二）微生物的选择培养1.稀释涂布平板法（活菌计数法），稀释涂布平板法基础操作包括：梯度稀释和涂布平板。2.稀释涂布平板法方法概述：由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。3.平板划线法的作用：分离纯化微生物。稀释涂布平板法的作用：分离纯化微生物、统计样品中活菌的数目。4.分离纯化微生物具体含义：将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到单菌落（即纯培养物）。6.③号试管稀释倍数为104。7．分解尿素的细菌的分离：分解尿素的细菌能合成脲酶，该酶能催化尿素分解产生NH3，以此作为细菌生长的氮源。要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方设计思路是培养基中除含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，只含有尿素一种氮源。8．稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌操作过程如下：采集土样→将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1mL菌液，滴加到培养基表面（多了不易被吸收）→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。注意：①在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多（0.1ml）的原因是培养基表面的菌菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。梯度稀释原因：培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落；目的：将聚集的菌体分散开，以便获得单菌落。②梯度稀释中，每次取样前需用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。③涂布器浸在酒精中的主要目的是为涂布器的灼烧灭菌做准备；为保证菌液均匀分布，应在涂布时转动培养皿。④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放到盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。⑤a.以上操作均在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染。b.若要分离并统计活菌数，应选用稀释涂布平板法。c.平板划线法不能用于活菌计数的原因是菌落连成片，无法计数。（三）微生物的数量测定1.微生物的数量测定方法：间接计数法——稀释涂布平板法直接计数法——显微镜直接计数法、滤膜法。2．稀释涂布平板法原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。3.样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。4.稀释涂布平板法的计数原则：（1）选择菌落数为30300的平板计数；（2）同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。5.稀释涂布平板法结果分析：（1）统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。（2）统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。6.C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M代表稀释倍数；则每g样品中的细菌数=（C÷V）×M。7.将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。8.恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。9．显微镜直接计数法原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。10.显微直接计数法使用的计数工具：血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等计数；细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。11.显微直接计数法优点：快速直观。12.显微直接计数法缺点：（1）统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。原因：不能区分死菌与活菌。（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.实验原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。2.实验步骤：土壤取样→制备培养基→样品的稀释与涂布平板→微生物的培养与观察。3.土壤取样：（1）取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。原因：细菌适宜在该环境中生长。（2）取样过程：取样时一般要铲去表层土。原因：细菌绝大部分分布在距地表38cm的土壤层。(3）注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。4.制备培养基:（1）作对照：牛肉膏蛋白胨培养基。作用：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。（2）实验组：选择培养基。特点：以尿素为唯一氮源。KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供无机盐、调节pH。尿素作用：氮源。葡萄糖作用：碳源。5.样品的稀释与涂布平板:(1)1g土的体积约为_1_ml，10g土加入到90ml无菌水，相当于稀释了10倍。假如104稀释度下涂布的3个平板的菌落数分别为42、40和38，则1ml稀释液中的菌株数为400，104稀释度的试管中的菌株数为4×103，102稀释度的试管中的菌株数为4×105，101稀释度的锥形瓶中的菌株数为4×107。101稀释度的锥形瓶中的菌株来自于10g土，所以1g土中的菌株数为4×106。（2）每个浓度至少设置4个平板。平板是实验组，为选择培养基，做3组的目的平行重复。4是对照组，为牛肉膏蛋白胨培养基。（3）整个实验还需要设置2个平板，是哪两个？不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。目的：用来判断培养基中是否含有杂菌（培养基灭菌是否合格）。（4）为获得菌落数在30300之间适于计数的平板，测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。（5）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样才能保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养（例如可以将1×1031×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养）。（6）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记，例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。（7）标记时注意标记在皿底，不能标记在皿盖。6.微生物的培养与观察（1）培养条件：细菌一般在3037℃的温度下培养12d。（2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（3）为什么选取菌落数目稳定时的记录作为结果？防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。（4）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。7.结果分析（1）说出下列各组培养基的目的：3组接种的选择培养基：对土壤中分解尿素的细菌分离和计。1组接种的牛肉膏蛋白胨培养基：判断选择培养基是否具有选择作用。不接种的选择培养基：验证选择培养基中是否含有杂菌。不接种的牛肉膏蛋白胨培养基：验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。（2）说出以下现象对应的结果分析：现象分析未涂布培养基上无菌落生长培养基未被杂菌污染未涂布培养基上有菌落生长培养基被杂菌污染牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目选择培养基具有选择作用（3）样品稀释操作成功的标志是什么？得到2个或2个以上菌落数在30300的平板。（4）得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定。进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定1.原理:分解尿素细菌合成的脲酶将尿素分解为CO2和NH3，NH3溶于水会电离出NH4+和OH，使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌；2.方法:在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。液体培养基可以直接看液体的变色情况；固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带；红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。拓展应用纤维素分解菌的分离纤维素分解菌的筛选方法是刚果红染色法。刚果红(简称CR)是一种染料，能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，透明圈的大小可反应细菌降解纤维素的能力。实验流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。选择纤维素含量丰富的土壤环境采集土样。1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。(x)2.培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性。(x)3.倒平板操作需要在酒精灯火焰旁。(√)

4.平板划线时，接种环放在火焰上灼烧冷却后再蘸取菌液，操作要在火焰旁进行。(√)

5.在稀释度足够高的菌液里，微生物可以被分散成单个细胞，从而能在液体培养基中形成单个的菌落。(√)

6.稀释涂布平板法统计的菌落数往往比实际数目高。(x)

7.测定土壤中细菌、真菌的数量选用的稀释范围相同。(x

)

8.在以尿素为唯一

氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。(√)

9.测定饮用水中大肠杆菌的数目可以用滤膜法，即将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，通过计算黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数目。(√)10.某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。接种后的培养m需放在光照培养箱中培养。(x)

11.在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌。(x)

12.培养微生物的培养基分装到培养皿后进行灭菌。(x)

13.统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(x)

14.消毒的原则是既杀死部分的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。(√)

15.平板划线法中每

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划线后要将接种环灼烧。(√)第一章发酵工程第3节发酵工程及其应用一、发酵工程的基本环节1.发酵工程的基本环节：菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵罐内发酵，产品分离、提纯等方面。(1)选育菌种①选育菌种目的：获得性状优良的菌种。②选育方法（菌种来源）：可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。③)菌种选育的重要性（意义）:优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。（2）扩大培养：①目的：获得更多的菌种。②原因：工业发酵罐的体积一般较大，因此，需要接入的菌种总体积大（数目多）。③扩大培养的培养基：一般为液体培养基。（3）配制培养基的要求：①在菌种确定之后，（结合菌种代谢特点）选择原料制备培养基。②在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。（即不断优化培养基）灭菌①目的：避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量。②培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌原因：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。（4）接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵罐中。大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制。（5）发酵罐内发酵①发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节。②发酵罐内发酵严格控制发酵条件的原因：a.环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成；b.严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态。③发酵罐内发酵要求：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。④不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵a.在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸。b.在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N乙酰谷胺酰胺。⑤发酵罐结构和用途a.培养物或营养物质的加入口、放料管、阀门：制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养。b.空气入口：控制溶解氧。c.观察孔、取样管、pH计、生物传感器装置、温度传感器和控制装置：通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程，取样管处抽取样品进一步检测。d.冷却水进入口、冷却水排出口：通过控制冷水流速调节罐温。e.排气管：调节罐压。f.电动机、搅拌叶轮：电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热。⑥现代发酵工程使用的发酵罐的优点：均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶氧量、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制，还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。(6)产品的分离、提纯①产品的分离、提纯目的：获得产品。②产品的两种形式：微生物细胞本身、代谢物。③分离、提纯产物采取手段：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。2.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用菌时，需要考虑哪些因素？（1）在低成本的培养基上能迅速生长繁殖。（2）生产所需代谢物的产量高。（3）发酵条件易控制。（4）菌种不易变异，退化等。3.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？（1）反复试验确定培养基的配方；（2）对培养基和发酵设备进行严格的灭菌；（3）随时检测培养液中微生物的数量、产物浓度等；（4）及时添加必需的营养组分；（5）严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件，使用计算机控制系统对各种条件进行监测和控制，以及反馈控制。4.在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处？传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物，很多时候不会再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离提纯产物。发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、吸附或离子交换等方法；在进一步纯化阶段，会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格后才能成为正式产品。5.在进行发酵生产时,排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么？不能；因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废气培养液进行二次清洁或灭菌处理。6.注意：（1）谷氨酸发酵常用菌种为谷氨酸棒状杆菌；（2）谷氨酸棒状杆菌的代谢类型为异养需氧型，其与有氧呼吸有关的酶主要存在于细胞膜上；（3）C:N的数值也会影响谷氨酸发酵过程：C:N=4:1时，菌体大量繁殖，谷氨酸产生量较少；C:N=3:1时，菌体繁殖受抑制，谷氨酸产生量较多。发酵工程的应用1.发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理。等特点，在食品工业、医药工业、农牧业等等许多领域得到广泛应用。2.食品工业是微生物最早开发和应用的领域。一直以来，与发酵有关的食品工业的产量和产值都居于发酵工业的首位。3.发酵工程在食品工业的应用包括：(1)生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。(2)生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。常见的食品添加剂种类：酸度调节剂、增味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂。食品添加剂优点：增加食物的营养，改善食品的口味、色泽和品质，延长食品的保存期。(3)生产酶制剂，如α­淀粉酶、β­淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶、脂肪酶等。酶制剂应用：食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等。酶制剂来源：少数由动植物生产，绝大多数通过发酵工程生产。4.发酵工程在生产传统发酵食品中的意义：使这些产品的产量和质量明显提高。5.啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的。6.发酵工程在医药工业的应用：（1）采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物。（2）直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。7.利用基因工程生产疫苗具体操作：将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。8.发酵工程在农牧业的应用：(1)生产微生物肥料。微生物肥料的作用：微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。(2)生产微生物农药。微生物农药的作用：利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。(3)生产微生物饲料。生产微生物饲料的原理：微生物含有丰富的蛋白质，且繁殖速度快。微生物饲料实例：①单细胞蛋白：以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。②乳酸菌：在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。9．在其他方面的应用（1）解决资源短缺与环境污染问题：随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。（2）将极端微生物应用于生产实践：自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在极端恶劣的环境（高温、高压、高盐和低温等环境）中正常生活。例如嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。细胞工程第一节细胞工程一、植物细胞工程的基本技术1.细胞工程概念：细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性生物工程。①原理方法：细胞生物学、分子生物学和发育生物学；②操作水平：细胞器、细胞或组织水平；③目的：得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品；④分类：植物细胞工程、动物细胞工程。（一）植物细胞的全能性1．概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。2.在生物生长发育过程中，并不是所有细胞都表现出全能性，比如：芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶。这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。3.是否表现出全能性的判断标准：细胞经分裂和分化后是否产生完整生物体。4.细胞具有全能性的原因（物质基础）：一般来说，生物体的细胞中都含有该物种的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所需的全部遗传信息。5.生物体生长发育过程中细胞不表现全能性的原因（不离体的细胞无法表现出全能性的原因）：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达（从而形成生物体的不同组织和器官）。6.是不是所有的活细胞都具有全能性？不是，例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。7.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？不是，例如动物的体细胞。8.比较一般情况下下列细胞全能性的大小(1)受精卵＞生殖细胞＞体细胞(2)分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞、(3)分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞(4)植物细胞＞动物细胞(5)幼嫩的细胞＞衰老的细胞9.以下例子哪些能够表现出了细胞的全能性：（1）、（3）、（4）、（6）、（7）(1)利用菊花茎段培养获得试管苗。(2)芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶。(3)受精卵发育成个体。(4)蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂。(5)造血干细胞可分化形成多种血细胞。(6)通过花药离体培养，获得单倍体幼苗。(7)胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞。(8)种子发育成完整植株。（二）植物组织培养技术1．植物组织培养概念：将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。2.离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体。3.植物组织培养的原理：植物细胞的全能性。植物组织培养的生殖方式：无性生殖。植物组织培养的分裂方式：有丝分裂。4.菊花植物组织培养（1）菊花植物组织培养的原理①植物细胞一般具有全能性；②脱分化：在一定的激素和营养等条件的诱导下，让已经分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程。结果：形成愈伤组织。③愈伤组织的特点：不定形的薄壁组织团块。一般不需要光照。此过程中涉及的生命活动只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化。④再分化：脱分化产生的愈伤组织，在一定的培养条件下，再分化出芽、根等器官，进而形成完整的小植株。需要给予适当时间和强度的光照，诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用。此过程中涉及的生命活动既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化。再分化实质：基因的选择性表达。⑤激素的作用：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向；生长素用量与细胞分裂素用来的比值结果比值高有利于根的分化，抑制芽的形成比值低有利于芽的分化，抑制根的形成比值适中促进愈伤组织的形成选材：经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等。原因：分裂能力强、分化程度低，容易诱导形成愈伤组织。（3）操作流程：①外植体的消毒：将流水冲洗后的外植体用酒精消毒30s，用无菌水清洗2～3次后，再用次氯酸钠溶液处理30min，用无菌水清洗2～3次。若想缩短次氯酸钠溶液处理时间应适当提高次氯酸钠溶液的浓度。②外植体的分割：用无菌滤纸吸去表面的水分，用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。大小应适宜。③接种：在酒精灯火焰旁，并且实验中使用的培养基和所有的器械及每次使用后的器械都要灭菌，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上做好标记。接种时注意外植体的方向，不要倒插。④培养：将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。定期观察和记录愈伤组织的生长情况。诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。⑤转移培养（再分化过程）：培养1520d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。⑥移栽：试管苗不可以直接移栽入土，需先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日，将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩上，壮苗后再移栽入土。（4）若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？为什么？愈伤组织中不含有叶绿体；培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。（5）植物组织培养中细胞表现出全能性的条件①离体（最关键）。②严格的无菌条件。③适宜的培养条件。④适宜浓度和比例的激素。⑤一定的营养条件。（6）为什么一定要离体才能表现出全能性？若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。（7）如何控制严格的无菌条件？①用体积分数为70%的酒精对手、超净工作台、外植体进行消毒,对外植体处理还需要质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液,清洗外植体需要使用无菌水。②)对培养基和器械进行灭菌；③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。（8）适宜的培养条件包括那些？①温度（例如菊花植物组织培养应为1822℃）。②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。（9）一定的营养条件如何保证？配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、特定浓度和比例的激素。（10）培养基组成①无机营养成分（水和无机盐）,②有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素）,③特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。注意：蔗糖的作用：提供能量，调节渗透压。培养基灭菌方法为：湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）。（11）为什么整个过程要保证无菌操作？避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。（12）整个过程中使用的培养基中是一成不变的吗？不是。分别为诱导愈伤组织的培养基→诱导生芽的培养基→诱导生根的培养基。（13）以上培养基中，生长素/细胞分裂素的比值大小是如何变化的？比值适中→比值低→比值高。（14）接种后，外植体被污染的可能原因：①培养基、接种工具灭菌不彻底。②外植体消毒不彻底。③操作过程不符合无菌操作要求等。（15）若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？空白对照：不加任何激素。实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。（三）植物体细胞杂交技术1.用传统的有性杂交方法都能得到杂种后代吗？为什么？不是，因为两种生物之间存在着生殖隔离。2．植物体细胞杂交的概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。3.植物体细胞杂交的主要步骤：植物细胞融合和植物组织培养。（1）在进行体细胞杂交之前，必须先去除细胞壁：用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体。去壁原因：细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）。（2）诱导原生质体融合的方法①物理法：电融合法、离心法等。②化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋－高pH融合法等。（3）细胞融合完成的标志：再生出新的细胞壁。植物体细胞杂交完成的标志：培育出杂种植株。（4）再生出细胞壁的相关的细胞器：高尔基体和线粒体。（5）验证再生出新壁的实验：质壁分离和质壁分离复原实验。4.纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常。5.①植物体细胞杂交的原理：细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性。②植物体细胞杂交的生殖方式：无性生殖。③植物体细胞杂交的分裂方式：有丝分裂。④植物体细胞杂交的涉及的可遗传变异类型：染色体变异。6.获得的所有细胞一定是需要的杂交细胞吗？不一定；诱导融合后的产物有三类：未融合的细胞、两两融合的细胞、多细胞融合体。7.植物体细胞杂交的意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。8.杂种植株包含两个物种的全部遗传物质，各种基因都包含在内，却未按照人们的要求表现出亲本所有的性状，例如“番茄马铃薯”并没有地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么？生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能像在原植株细胞内实现有序表达，因此不能按照人们的要求表现出亲本所有的性状。植物细胞工程的应用植物细胞工程的应用包括植物繁殖的新途径、作物新品种的培育、细胞产物的工厂化生产。（一）植物繁殖的新途径1.植物繁殖的新途径包括快速繁殖（也叫微型繁殖）和作物脱毒。2.快速繁殖(1)快速繁殖概念：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。(2)优点：可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖；无性繁殖可以保持优良品种的遗传特性；可实现工厂化生产。注意：扦插、压条、嫁接等不属于微型繁殖技术。3．作物脱毒（1）适用范围：无性繁殖的作物(马铃薯、草莓、香蕉）。（2）进行作物脱毒的原因：用无性繁殖的方式进行繁殖的作物，它们感染的病毒很容易传给后代，病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低、品质变差。（3）外植体选材部位：植物顶端分生区附近部位，如茎尖。（4）选分生区的原因：植物顶端分生区附近病毒极少，甚至无病毒。（5）优点：脱毒作物的产量和品质明显优于没有脱毒的作物。（6）作物脱毒具体操作过程：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。（7）脱毒苗是否不会再感染病毒？不是，脱毒苗≠抗毒苗。（8）实例：目前采用茎尖组织培养技术来脱去病毒，在马铃薯、草莓、甘蔗、菠萝、香蕉等主要经济作物上已获得成功。（二）作物新品种的培育1.作物新品种的培育包括单倍体育种和突变体的利用。2.单倍体育种(1)过程：花药（或花粉）离体培养（花药取自二倍体植株）→单倍体幼苗eq\o(→,\s\up9(染色体加倍))纯合子植株。当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株。(2)优点①后代是纯合子，能稳定遗传。②极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。=3\*GB3③大多数单倍体植株可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。为什么大多数单倍体植株可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料？大多数单倍体植株的细胞中只含一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现。2．突变体的利用（1）过程：（2）诱变处理对象：一般为愈伤组织。（3）产生原因：在植物的组织培养过程中，易受培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突变。（4）原理：基因突变和植物细胞的全能性。（5）诱变育种的缺点：突变具有不定向性和低频性，因此需大量处理实验材料。（6）诱变育种的优点：通过人工诱变提高愈伤组织的突变率，从而筛选获得抗病、抗盐、高产、优质的新品种，加快育种进程。(7)利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。（三）细胞产物的工厂化生产1.代谢产物的分类a.初生代谢产物：初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动；产物：糖类、脂质、蛋白质、核酸等b.次生代谢产物：植物代谢会产生一些一般认为不是生物生长所必需的，一般在特定组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。产物：一类小分子有机化合物（如酚类、萜类、含氮化合物等)2.细胞产物的工厂化生产的目标产物：次生代谢产物。3.次生代谢物作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。4.生产技术手段：植物组织培养技术（在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术）。5.过程：6.细胞产物工厂化生产主要利用的是哪种结构？愈伤组织。7.该过程中是否需要培养得到完整植株？一般不需要。8.优点：不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，对于社会、经济、环境保护具有重要意义；生产速度快。9．实例：利用紫草细胞的组织培养生产的紫草宁具有抗菌、消炎和抗肿瘤等活性。利用红豆杉细胞的组织培养生产的紫杉醇具有高抗癌活性。细胞工程动物细胞工程动物细胞工程包括：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植。一、动物细胞培养1.动物细胞培养概念：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2.动物细胞培养的原理：细胞增殖（有丝分裂）。3.动物细胞培养的地位：动物细胞工程的基础。4.动物细胞培养的关键操作：原代培养和传代培养。（一）动物细胞培养的条件1.动物细胞培养的条件：营养条件、无菌、无毒的环境、适宜的温度、pH和渗透压、适宜的气体环境。2.营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。未知营养条件：使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。其作用为：提供尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。动物细胞利用的营养物质包括蔗糖和淀粉吗？不包括。3.动物细胞培养的培养基的物理性质：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。4.保证无菌、无毒环境的具体措施（1）对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。（2）在无菌环境下进行操作。（3）还需要定期更换培养液。5.培养液的灭菌方法：湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）。培养用具的灭菌方法：湿热灭菌法（+烘干）或干热灭菌法。6.怎样保证无菌操作？对操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒，保证所有操作均在在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。7.为什么培养液需要定期更换？以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。8.如何防止培养过程中的微生物污染？在细胞培养液中添加一定量的抗生素。9.哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。10.多数动物细胞生存的适宜pH为。11.维持适宜渗透压的目的维持细胞正常的形态和功能。12.动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。其作用分别为：O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用维持培养液的pH。13.培养容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。培养仪器：含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱。因此动物细胞培养的气体环境为95%空气和5%CO2。（二）动物细胞培养的过程取动物组织→制成细胞悬液→转入培养液原代培养→分瓶→传代培养1.动物细胞培养取材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。取材原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。2.制成细胞悬液的步骤（1）将组织分散成单个细胞。（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。3.将组织分散成单个细胞的原因（1）从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；（2）能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。4.将组织分散成单个细胞的方法(1)机械法;(2)用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。5.（1）用胰蛋白酶分散细胞，可以说明什么问题？动物细胞间的物质主要是蛋白质。（2）可以用胃蛋白酶分散细胞吗？不可以。为什么？胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。6.酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤吗？不是，使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。7.体外培养的动物细胞的两大类：（1）能够悬浮在培养液中生长增殖。（2）大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）。8.两类细胞的生长特点（1）悬浮生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。（2）贴壁生长类：除会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻外，还会发生接触抑制。9.“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞最可能无接触抑制现象，并阐述原因：癌细胞，癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少。11．原代培养（1）原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即指动物组织经处理后的初次培养。（2）原代培养的具体做法：将初次制备好的细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。13．传代培养（1）传代培养：将分瓶后的细胞培养。（2）分瓶传代培养的具体做法:①收集细胞a.悬浮生长类：直接用离心法收集。b.贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。14.为什么动物细胞培养中需分瓶进行传代培养？细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，贴壁细胞还会发生接触抑制现象。15.离心的作用：在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶。17.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？未体现，动物细胞培养只是细胞增殖的过程。18.正常细胞不能一直传代培养下去；细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细