医用基因工程课件

第一章核酸的结构与功能一、核酸的種類與組成二、DNA的結構與功能三、RNA的結構與功能四、其他小分子RNA五、雙鏈RNA（dsRNA）一、核酸的種類與組成核酸的基本構成單位是核苷酸，是由多個核苷酸連接而成，又稱多聚核苷酸。（一）化學組成：堿基+戊糖+磷酸（二）種類：DNA/RNA兩類1.堿基2.戊糖3.核苷4.核苷酸

5.核酸DNA/RNA比較核酸堿基核糖磷酸嘌呤嘧啶DNAA、GC、T去氧核糖磷酸RNAA、GC、U核糖磷酸堿基DNA/RNA均有A、G、C，但DNA中由胸腺嘧啶T替換了RNA中的尿嘧啶U。戊糖RNA中為β-D-核糖，DNA中為β-D-2-去氧核糖。核苷堿基和核糖通過糖苷鍵連成核苷：嘌呤類以N9與核糖C1相連，嘧啶類以N1與核糖C1相連。核苷酸任何核苷與磷酸縮合（磷酸化）生成的磷酸酯稱為核苷酸。由核糖核苷（或去氧核苷）生成的磷酸酯稱核糖核苷酸（或去氧核糖核苷酸）。根據縮合在C5上的磷酸數目又可組成：核苷一磷酸（NMP/dNMP）；核苷二磷酸（MDP/dNDP）；核苷三磷酸（NTP/dNTP）。（如圖）核酸由多個核苷酸通過C3-C5的磷酸二酯鍵連接而成的多核苷酸鏈。種類有DNA、RNA兩種二、DNA的結構與功能（一）DNA的一級結構（二）DNA的二級結構（三）功能（四）三鏈DNA（一）DNA的一級結構核苷酸中去氧核糖和磷酸的一樣，但由於堿基不同而帶有不同的遺傳資訊，通常稱為堿基序列（又稱堿基對，bp）。人類有3×109bp。（二）DNA的二級結構1.Watson-Crick雙螺旋結構模型兩條逆向（5’-3’/3’-5’）平行的去氧核糖核苷酸鏈彼此間以A=T，G≡C的堿基氫鍵相連。（如圖1-7）。由於不同濕度、離子強度，分子構象呈現多樣性（多態性）有A、B、B’、C、C’、C’’、D、E、S、Z等構象。由於雙鏈的扭結或進一步盤繞可形成三級結構等超螺旋結構，其意義：①使DNA體積壓縮變小，節約空間位置；②使DNA遺傳資訊獲得穩定儲存。（三）功能1.可提供64個遺傳密碼的遺傳資訊（如表）2.可按半保留方式進行複製，穩定傳代3.可通過轉錄mRNA合成蛋白質，可遵循遺傳的中心法則。逆轉錄酶的發現又使該中心法則得以修正可由RNA逆轉錄成cDNA。（四）三鏈DNA三鏈DNA由於雙螺旋的一股輕微旋轉、折疊後，該股中的堿基可與雙螺旋的堿基以Hoogsteen氫鍵相連如TAT、CGC、TAA、CGG。（如圖）三鏈DNA結構類型、意義：①可作為精確切割DNA的靶序列的“分子剪刀”②抑制基因表達（轉錄）（反義DNA基因治療）③影響DNA與蛋白質結合及DNA複製、轉錄等，此外，還有四鏈DNA。三、RNA的結構與功能通常為單鏈，T被U替代（T是U的甲基取代衍生物）；由核糖取代去氧核糖，因RNA由DNA轉錄而成，故保留有DNA遺傳資訊。RNA由rnRNA、rRNA、tRNA三種類型共同擔負著基因表達、表達調控和蛋白質合成的任務。四、其他小分子RNA（一）細胞核內RNA（hnRNA和SnRNA）（二）反義RNA（三）核酶（一）細胞核內RNA（hnRNA和SnRNA）DNA轉錄產物很不均一，故將mRNA前體稱為不均一核RNA（核內hnRNA）。此外，核內還存有小核RNA（SnRNA），約為70~300個核苷酸，可參與真核生物的RNA剪接。（二）反義RNA反義RNA：指能與特定mRNA互補結合的RNA片斷，其功能：①阻斷mRNA的翻譯②抑制DNA複製③可選擇性地關閉基因。意義：①參與基因調控②可用於基因治療（病毒、腫瘤）（三）核酶

核酶是指具有催化活性的RNA，命名為核酶（ribozyme），又指“酶RNA”。酶RNA不用於RNA酶（Rnase），前者是RNA，後者是蛋白質。核酶呈錘頭狀（如圖）。

由13個保守核苷酸殘基好個螺旋結構域構成的錘頭狀二級結構，剪切反應是在GUX序列的3’端自動發生。催化結構域（R）可據底物（S）和R在錘頭結構中的相對位置行使對S（底物）的剪接。功能：參加RNA剪切和降解。意義：①腫瘤的基因治療（人工合成錘頭狀核酶）②HIV-1等病毒病的治療五、雙鏈RNA（dsRNA）小分子的雙鏈RNA能引發轉錄後的基因沉默（Post-transcriptionalgenesilencingPTGS）或RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。該dsRNA在Dicer酶作用下可被降解，進而發生基因干擾（或沉默），也就是說阻斷了基因的表達。（機理如圖）特點：①不同SiRNA序列可行使特異識別，切割作用②mRNA被切割後所產生的dsRNA在RNA依賴性RNA多聚物下可發生PCR擴增起放大干擾效應③dsRNA可進行人工設計合成，也可用於載體構建體外擴增或基因敲除工具，可應用於病毒病、腫瘤基因治療。第一節

基因的概念

一、基因與“遺傳因數”二、基因與染色體三、基因與蛋白質四、基因與DNA五、基因密碼的破譯六、基因的概念七、基因的新概念一、基因與“遺傳因數”對遺傳物質基礎的認識有個發展過程，孟德爾（G.Menodel）在1857～1864年以豌豆為材料進行雜交實驗的研究中,提出“遺傳因數”決定和控制著生物體的各種性狀。1909年丹麥生物學家W.Johannsen為了強調“遺傳因數”與生命的關係,他根據希臘“給予生命”之義的詞“gene”（基因）創造性地用“gene”這個術語來代替“遺傳因數”。基因這個詞當時被用來描述遺傳性狀，但對基因的物質概念還未能認識，只是遺傳的一個符號。孟德爾的豌豆雜交試驗

遺傳因數是成對的，一個來自父本，一個來自母本，形成配體時彼此分開，在性細胞中是成單的，雜交子一代各自保持獨立和純一狀態，形成配子時又彼此分開，互不混雜，完整地傳給後代，雌雄配

子結合有等同隨機結合的機會。

圓形種子＋皺形種子

雜交第一代(均為圓形)

回交

圓形豆皺形豆

5474粒1850粒

3：1黃色圖形＋綠色皺形雜交第一代(均為黃色圓形)回交黃色圓形豆黃色皺形豆綠色圓形豆綠色皺形豆315粒121粒108粒32粒9

：

：

：331二、基因與染色體1910年～1926年,美國的摩爾根（T.H.Morgan）選用果蠅做研究材料，發現了基因連鎖和交換現象，創立了遺傳的染色體理論（Chromosomoltheoryofinheritance），繪製了基因連鎖圖,接受了孟德爾的遺傳原理,指出遺傳物質必須由某種獨立的要素組成,即遺傳因數或叫做基因。從而證明了基因是位於染色體上呈直線按順序排列的遺傳單位，基因是攜帶遺傳資訊的結構單位，又是控制遺傳性狀的功能單位。摩爾根果蠅雜交試驗有4對染色體，一對小粒狀，2對V形，一對呈棒狀XX或XY（性染色體）

X1X2（紅眼）+XWY（白眼）（野生型）（突變型）雜交子一代（雌雄均為紅眼）

X1XW，X1Y，X2XW，X2YX1X1，X1Y，XWX1，XWY，X2X1，X2Y，XWX2，XWY¼為紅眼雄性及白眼雄性三、基因與蛋白質1941年G.W.Beadle和E.L.Tatum應用X射線誘導鏈孢黴菌（Newosporecrassa）在DNA損傷修復後,產生了大量營養缺陷性突變體,提出了“一個基因一種酶”學說,後來又修正為“一個基因一種蛋白質”的學說,或“一個基因一種多肽鏈”學說。

四、基因與DNA1928年美國O.T.Avery首次證明了控制遺傳特性的物質是DNA,而不是蛋白質,染色體上的基因為DNA分子。1953年J.watson和F.Crick根據堿基配對規律和DNA分子的X射線衍射圖譜等實驗,提出了DNA分子的雙螺旋結構。1958年證明了DNA半保留複製和DNARNA蛋白質合成的中心法則（如圖）。遺傳中心法則五、基因密碼的破譯1961年F.Crick,S.Brenner,M.W.Nirenberg,H.G.Khorana等確立了每三個核苷酸可作為決定一個氨基酸的密碼子。1964年64種三聯密碼子全部被破譯公佈。64種密碼子中有61個密碼子可用於編碼20種氨基酸,有3個密碼子為終止信號,只表示鏈的終止,不表達任何氨基酸。其中AUG為啟始密碼子，並具有通用性、偏愛性和簡並性。遺傳密碼的兼併性六、基因的概念按照分子生物學理論，基因的概念應當是指編碼有功能蛋白質多肽鏈或RNA分子所必需的全部核酸序列（即DNA序列）。根據這個概念，一個基因不僅含編碼蛋白質肽鏈或RNA分子的核酸序列,還包括保證轉錄所必需的非編碼的調控序列即位於編碼區上游5’端的啟動子非編碼序列、內含子（intron）和位於編碼區下游3’端的終止子非編碼序列。編碼區是發揮基因功能的結構基因（或功能基因），而起調控、啟動和終止作用的非編碼區屬於調控基因。

七、基因的新概念1、移動基因2、斷裂基因（splitgene）3、重疊基因4、假基因5、重複序列及重複基因1、移動基因

移動基因（movablegene）又叫轉位因數（transposableelements）,由於它可以在染色體基因組上移動，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumpinggene）,這種基因是J.A.Shapiro在研究大腸桿菌高效突變時發現的。有三種類型：1.插入序列（insertionsequences,簡稱IS），其長度為數百個到數千個堿基對之間（如圖1-1）。2.轉位子（Tn)，即兩側的IS和一個中心序列（帶有遺傳資訊）3.噬菌體Mu和D108，其轉位作用如圖1-2。2、斷裂基因（splitgene）

在真核細胞中的核苷酸序列中間插入與氨基酸編碼無關的DNA間隔區段，使一個有功能的結構基因分隔成不連續的若干區段，將這種編碼序列不連續，有間隔區段的DNA片斷稱為斷裂基因。這種非編碼間隔區段DNA稱間隔子（內含子），有轉錄和編碼功能的編碼序列稱表達子。原核細胞無內含子。其二者mRNA剪輯作用如圖1-3，1-4，1-53、重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時為相鄰兩個基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因（overlappinggenes）,在

174噬菌體有兩種類型的重疊基因（圖1-6）。4、假基因

在珠蛋白基因簇（genecluster）各片斷核苷酸序列分析時發現，除了有正常的功能基因之外，還有功能失活的特殊序列片斷，它不能行使表達功能。該類無表達功能的畸變核苷酸基因序列片斷，稱為假基因。其產生原因如圖1-7、1-85、重複序列及重複基因

幾乎所有的真核細胞（酵母除外）的基因組DNA中都具有重複序列（repeatedsequence）,它無轉位移動能力，因此它區別於轉位作用的IR（invertedrepeat）。IR是指序列的重複性。但無基因序列的交叉重疊性，故不同於重疊基因序列。重複序列可分為四種類型：(1)不重複序列，是唯一的序列，只有一個拷貝。(2)低度重複序列，一般有1-10個拷貝。(3)中度重複序列，有數十至數萬（105）拷貝。如圖1-9、1-10(4)高度重複序列拷貝數可達106以上,包括衛星DNA、高豐度SINE家族的Alu序列。第二節

基因組

“基因組”是表示某物種單倍體的總DNA，對於二倍體高等生物其配子的DNA總和即為一組基因組。不同生物基因組數目不同，如表研究得較多的為以下三類基因組：

一、病毒基因組二、細菌基因組三、真核生物基因組第三節

基因工程的定義和研究內容

基因工程的定義通常是指在體外把核酸分子（基因）組合到特定的載體上（病毒，質粒，噬菌體等）並使之進入（或導入）到原來沒有這類分子的宿主體內，能使基因在宿主內繁殖或表達生物活性物質。基因工程的核心內容是重組DNA技術，還包括體外DNA突變，體內基因操作以及基因的化學合成等。第四節

基因工程的發展史

一、四大里程碑二、三大技術發明三、基因工程的誕生病毒基因組特點：1.結構簡單，無細胞結構，基因組為DNA或RNA組成，有雙鏈/單鏈，環狀/線狀。2.有調控元件和轉錄元件組成，轉錄元件可轉錄成為多順反子mRNA。3.有重疊基因。4.逆轉錄病毒（RV）可使RNA變cDNA其結構如圖，具U3RU5的長末端重複序列（LTR），具隨機整和能力，可用作病毒載體。細菌基因組約有三千個基因，無內含子，為雙鏈DNA，但無核仁、核膜，多為單拷貝，無重疊基因，有多種功能調控區，有複製起始區、終止區、轉錄起始區，終止區常有反向重複序列。另外有質粒存在，質粒可作為載體。真核生物基因組特點：大而複雜，為雙倍體，有低中高重複序列，多為斷裂基因，基因組中非編碼區多於編碼區（占90%），大多於蛋白質結合形成染色體，DNA占35%，RNA占5%，其餘為蛋白質（組蛋白或非組蛋白）與C值矛盾：一般高等生物的全部DNA量（稱C值）均大於低等生物，但某些植物或兩棲動物的C值比人高出幾十倍，這種與進化複雜性不一致的C值反常現象稱為C值矛盾。類型多基因家族四大里程碑遺傳物質的明確——DNADNA雙螺旋結構理論（半保留複製及其中心法則）基因遺傳密碼子的破譯基因轉譯載體的發現三大技術發明工具酶的發明：內切酶、合成酶、連接酶基因合成和測序（合成儀、測序儀）PCR技術（PCR擴增儀）基因工程的誕生1972年是基因工程的誕生之年。美國斯坦福大學P.Berg將SV40的DNA導入噬菌體載體在大腸桿菌中獲表達。S.Cohen等人將抗四環素、新黴素基因的質粒轉化大腸桿菌，獲得抗四環素，抗新黴素重組菌落，從而揭開基因工程的序幕。類型單拷貝序列：人類約占60%~65%中度重複序列：長短300~700bp，重複次數達105。通常為Alu、KpnⅠ、Hinf、rRNA、tRNA、組蛋白基因等。高度重複序列：衛星DNA及微衛星DNA反向重複序列：人類約占5%，長度300bp在複性時，若有間隔序列，可形成髮夾結構，若無間隔序列，可形成回文結構，可能與複製、轉錄調控有關。多基因家族指來源相同，結構相似，功能相關的基因在染色體上成串存在，形成多基因家族。如rRNA、tRNA、組蛋白基因等為成串的，干擾素、珠蛋白、生長激素等為分散的。衛星DNA衛星DNA又稱隨體DNA，由CsCl超速離心後，分散在主峰旁，形似衛星分佈而稱之。一般5-10bp短序列，人類為171bp，保護和穩定染色體。近來又發現微衛星DNA，又稱簡單重複序列，一般由1-6bp的串聯重複單位組成，有2bp、5bp、6-7bp不等，以2bp為常見。人類基因組中2bp（≥14）的重複序列呈高度多態性。採用限制性長度多態性（RFLP）分析，可用於基因連鎖的遺傳標記，廣泛用於診斷。第一節

基因表達的概述和基本條件

一、基因表達的基本概念二、基因表達的基本條件三、真核基因在原核細胞中表達及調控第二節

在大腸桿菌中影響外源基因表達的因素一、啟動子結構對表達效率的影響二、表達載體的選擇三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用四、mRNA的一級結構與基因表達五、mRNA的二級結構對翻譯起始的影響六、mRNA穩定性的影響七、轉錄終止區對外源基因表達效率的影響八、轉錄後的若干因素與基因表達的關係九、宿主選擇對表達的影響十、培養條件的控制對表達效率的影響一、基因表達的基本概念

生物體的遺傳資訊都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質DNA上,基因表達是目的基因DNA在導入的細胞內轉錄成mRNA,再以mRNA指導翻譯成蛋白質。基因的表達依賴於有效的轉錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯後的加工處理等各個環節的調節作用，其中轉錄最為關鍵，原核的基因表達過程和方式與真核細胞有顯著不同。二、基因表達的基本條件1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯位及錯碼。否則會導致編碼錯誤的蛋白質分子，特別是目的基因序列內部應不含兩端酶切位點的識別序列。2.插入的外源基因必須放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。3.外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉錄（如無內含子），轉錄後的mRNA在菌體必須相當穩定，並且能有效地進行翻譯，轉譯的蛋白分子在菌體內不致於受菌體蛋白酶的降解。

三、真核基因在原核細胞中表達及調控真核基因在原核細胞中表達及調控的特點㈠有效轉錄及其調控元件

㈡正確轉譯

㈢原核表達載體的構建㈠有效轉錄及其調控元件

1.RNA聚合酶2.啟動子及其轉錄作用的啟動（啟動子的概念、分類）3.轉錄作用的終止4.轉錄的弱化作用㈡正確轉譯

1.起始密碼子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖體結合位點（RBS，又稱SD序列）㈢原核表達載體的構建

原核表達載體的構建的要求1.表達載體類型2.表達載體的舉例3.包涵體表達載體啟動子⑴乳糖啟動子（Lac）⑵Trp啟動子⑶Tac啟動子⑷噬菌體的PL和PR啟動子⑸脂蛋白啟動子（LPP）啟動子結構對表達效率的影響啟動子-35區和-10區序列與通用轉錄序列一致，間距為17bp，大於17bp效果差，不同產物選用不同啟動子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動子效果好。表達載體的選擇載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產物選用不同類型表達載體。外源基因（cDNA）中密碼子的作用細菌中基因表達對密碼子有偏愛性，不偏愛的稀有密碼子（AGA、AGG）表達效果差，特別當有AGA-AGG連續序列存在時表達效率低mRNA的一級結構與基因表達啟始密碼子：表達效率AUG>GUG>UUGSD序列：較長的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻譯區，若有5’-UGAUCU，則有增強作用。mRNA的二級結構對翻譯起始的影響mRNA形成二級結構時，可產生莖環。若SD序列、AUG位於莖環內或髮夾內，轉譯受抑制；在莖環外則有利於轉譯。見表6-1mRNA穩定性的影響REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護作用。真核基因在原核細胞中表達及調控的特點只有一種RNA聚合酶以操縱子為單位來完成基因轉錄基因轉錄無RNA剪接功能因無核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉錄與翻譯是連續進行的轉錄產物在多聚核糖體上合成，同時合成多條肽鏈有特有SD序列，調控mRNA與核糖體有效結合和翻譯的起始無糖基化功能RNA聚合酶原核細胞只有一種RNA聚合酶，當其核心酶與σ因數結合，形成全酶後，才能識別DNA上的啟動子進行轉錄。啟動子的概念啟動子是位於結構基因上游，轉錄起始調控所必需的一段DNA序列，內含-35區（與σ因數結合）和-10區（和核心酶結合）的保守序列。當啟動子與全酶結合後可在+1轉錄起始點開始轉錄，如圖6-1。轉錄作用的終止由轉錄終止子發揮作用，凡能使轉錄終止的有關的DNA的序列稱終止子。強終止子：不依賴ρ因數發揮終止作用，回文序列中G/C配對多，有四個以上U，致使RNA聚合酶構象改變而終止轉錄。如圖6-9,如圖6-10弱終止子：依賴ρ因數發揮終止作用。如圖6-11轉錄的弱化作用轉錄的弱化作用使轉錄沒有到達終止信號處而中途停止轉錄，使mRNA轉錄發生部分停止，而不是發生全部停止。

起始密碼子起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細菌中也有罕見的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達作用AUG＞GUG。核糖體結合位點轉錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發生有效結合和轉譯所需要的序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互補其互補程度、SD與AUG間距等與轉譯效果有關。如圖表達載體類型表達載體的類型主要有四種：非融合型表達載體，如PKK223-3如圖6-14分泌型表達載體，如PINⅢ-ompA1如圖6-15融合蛋白型表達載體，如PGEX如圖6-16包涵體型表達載體，如pBV220如圖6-17原核表達載體的構建的要求完整的表達載體（質粒）應有強啟動子（P）、終止子（T）、多個酶切位點、有抗性標記、複製子和RBS的SD序列。（如圖6-13）還應結合考慮：質粒的拷貝能力和穩定性，轉譯蛋白的表達形式和存放地點（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質的分子量、性質和穩定性以及選擇合適宿主細胞。乳糖啟動子（Lac）無乳糖時，調節基因（I）產生阻遏蛋白與操縱基因結合，阻止RNA聚合酶結合進而阻止轉錄；有乳糖時，乳糖能與阻遏蛋白結合，使其變構解離而行使轉錄功能。如圖6-2而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖）誘導轉錄。Lac啟動子改建如圖6-3、6-4(a)

(b)Trp啟動子色氨酸啟動子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時，二者結合，阻遏蛋白變構啟動而與啟動子結合，阻止RNA聚合酶的轉錄。無色氨酸時，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導劑，誘發色氨酸啟動子轉錄。（如圖6-5）同時，衰減子對Trp轉錄也有調節作用（如圖6-6）Tac啟動子Tac啟動子是由Trp啟動子和Lac啟動子構建而成的雜合啟動子，-35區為Trp啟動子順序，-10為LacUV5啟動子順序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動子只需用IPTG誘導轉錄即可。如圖6-7噬菌體的PL和PR啟動子PL為λφ左向啟動區，PR為右向轉錄啟動區，與CI阻遏蛋白結合，可抑制OL或OR

轉錄，但CI在42℃誘導轉錄（如圖6-8）。脂蛋白啟動子（LPP）脂蛋白為細胞外膜蛋白，細菌中含量高，該啟動子表達效率高，由信號肽可將基因表達產物分泌到胞外，常用來構造分泌型表達載體。第一節

真核細胞基因表達的調控

一、真核生物基因表達的特點及優勢二、真核細胞表達及調控元件第二節

哺乳動物細胞表達系統的選擇標記基因

一、胸苷激酶基因選擇標記（定義）二、二氫葉酸還原酶基因選擇標記三、新黴素抗性基因選擇標記四、氯黴素已醯轉移酶基因選擇標記五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因第三節

真核細胞表達系統的載體種類

一、載體的類型二、幾種常用的真核表達載體一、真核生物基因表達的特點及優勢

1.細胞的全能性2.轉錄和翻譯分開進行3.有相當大的非編碼區（調控序列）4.有三種不同RNA聚合酶參與轉錄5.初級轉錄產物能進行剪接加工修飾6.不存在操縱子結構7.基因多拷貝，功能基因分散在不同區域，分別轉錄二、真核細胞表達及調控元件

（一）真核生物基因轉錄水準的調控

（二）轉錄後水準的調控

（三）翻譯水準的調控

胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細胞中都有表達,是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉變成為dTMP,繼續磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。一、載體的類型1.質粒型載體2.病毒載體3.整合型表達載體4.游離型表達載體5.暫態表達載體6.穩定性表達載體7.非複製性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體二、幾種常用的真核表達載體㈠逆轉錄病毒載體1.卸甲載體2.穿梭載體㈡痘類病毒載體㈢HSV-Ⅰ單純皰疹病毒載體1.重組病毒型載體2.重組質粒型載體3.裂解型病毒載體

（一）真核生物基因轉錄水準的調控

基因調控的順式作用元件啟動子增強子RNA剪接信號負調控元件終止子和polyA信號基因調控的反式作用因數概念反式作用因數主要作用規律（二）轉錄後水準的調控mRNA前體加工：轉錄的mRNA前體經5’加帽，3’酶切加尾去除內含子後，產生成熟mRNA，通過核孔進入胞質中。RNA編輯（RNAediting）（三）翻譯水準的調控翻譯起始序列eIF-2的磷酸化反應由範本來源的遺傳資訊，進而可編碼產生不同氨基酸序列的多種蛋白質，這是生物適應性的保護措施。順式作用元件順式作用元件為一些能與DBP結合的特定序列DNA片段,位於真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉錄起始位點和RNA聚合酶的轉錄按效應和功能可分為啟動子、增強子、RNA間接信號、負調控元件、終止子等調控元件。反式作用因數主要作用規律同一DNA序列可被不同蛋白質識別同一蛋白質因數可與多種不同DNA序列發生聯繫，多數是通過蛋白質-蛋白質先相互作用後，再與DNA結合，發揮調節作用。反式作用因數的自身生物合成有相當大的可變性、可塑性。反式作用因數與順式作用元件相互作用的特定結構域，有兩種類型：通用轉錄因數的結構域為識別特異DNA的DNA結合結構域，如：鋅指結構。轉錄調節因數的結構域又稱轉錄活化結構域，如：酸性α-螺旋結構域。不同結構域各自的特徵不同結構域各自的特徵通用轉錄因數的DNA結合結構域鋅指結構亮氨酸拉鏈螺旋-轉角-螺旋（HTH）螺旋-環-螺旋轉錄調節因數的轉錄活化結構域RNA編輯（RNAediting）RNA編輯是在轉錄時或轉錄後，能夠改變RNA分子編碼特性，是與剪切形式不同的一種修飾形式，如可使mRNA某位點密碼子CAA轉變為UAA，使C變U，編輯的結果形成了UAA終止密碼子，在編碼酶的作用下，除使C變U，還可在RNA上添加多個U或呈單個C的添加，使前體mRNA變成成熟mRNA時，通過插入或替換方式，可改變和擴大原遺傳資訊，編碼多種蛋白,是生物的適應性保護。翻譯起始序列

在ATG起始密碼子周圍要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻譯起始，若發生突變，其翻譯水準可下降10倍。在起始AUG上游若有比較多的二級結構序列，也會影響翻譯，建議外源基因的5’端AUG上游序列不宜過長。eIF-2的磷酸化反應eIF-2為轉譯起始因數-2是蛋白質合成起始階段13種起始因數中最為關注的因數。若轉入動物細胞中的質粒DNA的兩條鏈一旦都發生轉錄，就會形成雙鏈互補mRNA，而啟動胞內的雙鏈RNA啟動的蛋白激酶（DAIPK）該激酶可使eIF-2的α-亞基磷酸化，轉譯受抑，為防止該激酶活化，常在載體上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA，能阻止雙鏈RNA對DAI激酶的啟動作用，使轉譯得以正常進行。一、胸苷激酶基因選擇標記外源基因+載體(TK+)的重組體導入TK-細胞中，在HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）選擇培養基中篩選，TK-細胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+細胞可存活，以此進行篩選。（HSV-1的TK基因轉染細胞加GCV後被殺死，如小鼠LMTK-細胞。）注：TK++BrUdR因摻入後對紫外線敏感而死亡，

TK-+BrUdR因不摻入，對紫外線不敏感而存活。二、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）選擇標記DHFR是合成dATP和dGTP的關鍵酶。常用DHFR—的CHO細胞因不能合成四氫葉酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養基中生長。在不含該培養基中導入該標記基因重組子，則可篩選出陽性克隆，也可將DHFR基因置在強啟動子下高表達或通過DHFR基因突變以提高抵抗高濃度氨甲喋呤（抗MTX的抗性）的能力，從而篩選陽性克隆。三、新黴素抗性基因選擇標記新黴素類似物G418抗生素，可影響80s核糖體RNA功能，對細胞有毒性。新黴素抗性基因neo的載體可在真核細胞中表達產生新黴素磷酸轉移酶能使G418失活，可在含G418培養基中篩選重組體轉化的陽性克隆細胞。陽性克隆存活，陰性者死亡。五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因哺乳動物細胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動物細胞可通過IMP生成GMP。當用IMP脫氫酶抑制劑黴酚酸，抑制了GMP的合成，使細胞失去合成DNA能力而死亡。將含XGPRT基因的重組體導入真核細胞後，在轉化細胞中就能表達XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養基中通過XMP中間體補救合成GMP，使DNA合成正常進行，加入黴酚酸後，陽性克隆因不受黴酚酸的抑制而存活，而未轉化的陰性細胞則受黴酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細胞。1.質粒型載體

質粒型載體（穿梭載體）：實際上是病毒質粒型載體，共有兩套複製元件和選擇標記，在原核中複製，真核中表達。2.病毒載體

病毒載體種類多，SV40、Adv、RV、HSV-1、痘苗V。可在敏感細胞中複製，表達外源基因，有的還可通過整合後表達。3.整合型表達載體

RV、SV40可攜帶外源基因整合到宿主細胞的基因組中進行表達。4.游離型表達載體

該病毒載體是以完整的或缺陷病毒形式攜帶外源基因導入宿主細胞後不發生整合，可在胞漿中游離複製，表達外源基因，如痘苗V、Adv。5.暫態表達載體暫態表達載體（轉染後70-90h左右）：含病毒複製子的病毒載體，可攜帶外源基因導入宿主細胞，不整合到染色體上，只在細胞內進行暫時性表達，不能隨細胞傳代，隨後逐漸降低或消失。常用SV40複製子載體，在COS細胞中表達，由於載體複製，若超過104個/細胞，細胞不能承受而死亡。6.穩定性表達載體將外源基因與具標記基因（DHFR）病毒載體轉染動物細胞（CHO），可將基因整合到細胞染色體上，可隨細胞轉錄表達和傳代。（CHO、DUKX-B11因加入氨甲喋呤而死亡，依此篩選陽性克隆。）7.非複製性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體

HSV-1病毒去除α極早期基因，失去複製能力，但攜帶外源基因轉染細胞後高效表達，毒性小，轉染和表達能力強。8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體

HSV-1病毒去除了β早期基因，而不能產生DNA合成所需的酶，該病毒在靜止細胞中不能複製和裂解細胞，但在高度分裂活躍的細胞中（如腫瘤）可複製並裂解感染的細胞，因分裂活躍細胞可提供病毒複製所需的DNA合成酶，複製時只殺死腫瘤細胞，對正常細胞無損害。㈠逆轉錄病毒載體

逆轉錄病毒載體是RNA單鏈，pol基因產生逆轉錄酶，使單鏈生成雙鏈。有5’、3’的U3RU5的長末端重複序列，有TATA強啟動子和加尾功能，經體外包裝，可整合表達。穿梭質粒載體組裝基因後，可由輔助病毒協助或經體外細胞包裝，形成具感染性假病毒顆粒，再感染宿主細胞進行表達。㈡痘類病毒載體

已用於構建多價活疫苗載體（HBsAg、HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-Ⅱ、EBV等。該載體的雙鏈DNA的大病毒載體，組裝量大，安全，可在細胞獨立複製，表達。1.重組病毒型載體

在HSV-1非必需區插入外源基因的重組體DNA與野毒株共轉染細胞，可發生同源重組，通過LacZ篩選，轉染效率高，無需輔助病毒，但有毒性作用。啟動子大多位於基因5’端上游區，是一種與基因轉錄起始有關的5’端DNA序列，在-30bp區有TATAbox，可引導RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始，在-70~-80bp區還有GCbox，可協同調節轉錄起始頻率和提高轉錄效率。常用的啟動子有RSV啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子。增強子增強子是一類可使啟動子的基因轉錄效率顯著提高的順式作用元件，本身無啟動子活性，可獨立存在與上游區、下游區或基因內部，可進行遠距離增強啟動作用，而且無方向性。它有特徵性序列，常由812bp組成，以單拷貝或多拷貝的形式存在。增強子可使轉錄效率增強10-100倍，通常來源於SV40、RSV或CMV病毒。一旦增強子的作用使表達產物對細胞有毒性時，最好改用誘導型啟動子來表達外源基因，如熱休克啟動子、金屬硫蛋白啟動子。RNA剪接信號雖然cDNA來源的基因轉入哺乳類細胞後，其表達不受有或無內含子的影響，但在該細胞中表達最好有一段內含子序列的剪接信號，以提供對cDNA基因表達的需要，常用SV40的小t抗原的內含子序列來作為cDNA中的內含子剪接序列。負調控元件沉默子和衰減子為轉錄的負調控元件，它們與反式作用因數相互作用而起作用，不受距離、方向、基因來源的限制。終止子和polyA信號真核基因轉錄的確切終止信號和終止機制目前尚不清楚，現發現在範本DNA分子3’端有一終止序列，稱終止子，產生具有polyA尾的轉錄序列，在DNA區域內G/T簇。如SV40中的終止子序列為AGGTTTTTT的DNA序列，並有髮夾結構的反向重複序列。polyA可使mRNA穩定其多聚腺苷酸化需要兩種序列：①位於polyA位點下游的GU或U豐富區，②位於polyA上游11-30bp處的6bp高度保守序列（5’-AAUAAA）與轉錄後的RNA切割和加尾有關。反式作用因數的概念反式作用因數是一組能直接或間接地與DNA的順式作用元件特定序列結合，發揮調節作用的核內非組蛋白，即DNA結合蛋白（DBP），DBP又稱轉錄因數（transcriptionfactor,TF）分通用轉錄因數及轉錄調節因數兩大類。基因表達的組織特異性及細胞週期特異性受上述元件和因數的相互作用所決定，通用轉錄因數中識別TATAbox的為TFⅡD，可與RNA聚合酶Ⅱ結合使轉錄起始，識別GCbox的DBP為SP1，可調控轉錄效率。鋅指結構鋅指（zinefinger）結構：由兩個半胱氨酸（Cys）和兩個組氨酸（His）殘基通過位於中心的鋅離子結合成一個穩定的指狀結構，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結合有關。一個蛋白分子有2-9個鋅指重複單位，由指部堿基或極性氨基酸（賴氨酸Lys、精氨酸Arg）結合於DNA雙螺旋的深溝內。結構域為以鋅輔基螯和形成的環狀結構作為活性結構域。亮氨酸拉鏈

亮氨酸拉鏈（Leucinezipper，LZ）：為兩組走向平行帶亮氨酸的α-螺旋形成的對稱二聚體，每個亞基含4個亮氨酸，每2個Leu之間相隔6個氨基酸。於α-螺旋的某一側面，每2圈（3.6堿基/圈）就出現一個Leu，排成一排，使2個α-螺旋蛋白分子間形成一條拉鏈，只有在形成二聚體拉鏈後，鏈上富含的鹼性氨基酸區可與DNA結合。結構域為鏈上鹼性區和亮氨酸拉鏈形成的穩定結構為基礎。螺旋-轉角-螺旋（HTH）

螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）：此α-螺旋中含鹼性氨基酸較多，其所帶的正電荷基團可與帶負電荷的DNA鏈結合。螺旋-環-螺旋螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）：HLH與HTH結構相似，不同之處為兩個α-螺旋之間的肽鏈為非螺旋的環，在α-螺旋附近的氨基酸也有鹼性區，為與DNA結合所必需，DNA結合性質與亮氨酸拉鏈相似。第五章

分子克隆常用的工具酶

第一節

限制性核酸內切酶與DNA分子的體外切割第二節

DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節

其他工具酶第一節

限制性核酸內切酶與DNA分子的體切割

限制性核酸內切酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，並由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。一、寄主控制的限制與修飾作用如圖2-1，圖2-2二、限制性核酸內切酶的製備方法三、限制性核酸內切酶分類和命名四、Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特性五、影響限制性內切酶活性的因素分類：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：識別和切割位點不固定，隨機性。

Ⅲ：核酸內切酶活性和甲基化活性是不分開的。Ⅱ：能在識別位點處切割DNA，切割位點固定。核酸內切酶活性和甲基化活性是分開的。常用。四、Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特性識別序列：1.4~7個核苷酸組成的特定核苷酸序列

2.回文結構：兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。

EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’經限制酶切割後的位點,DNA斷裂類型1.粘性末端(1)3’-OH單鏈延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P單鏈延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ

5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

3’-CTTAAG-5’2.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’兩種特殊的限制酶(1)同尾酶

識別位點不同，酶切後產生同樣的粘性末段的兩種酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶識別序列相同，對甲基化切點敏感性不同的兩種酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同識別序列GATC，但對GmeATC切點,前者不能切，後者能切。五、影響限制性內切酶活性的因素1.DNA的純度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大腸桿菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改變限制酶的識別特性3.溫度4.分子結構5.限制酶的緩衝液星號活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT第二節

DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、DNA連接酶

DNA連接酶（Ligase）是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復，不能連接單鏈DNA或裂口.

溫度二、DNA分子的體外連接二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點的磷酸化2．平末端DNA片段的連接（1）T4DNA連接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化學合成的銜接物連接DNA分子第三節

其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆轉錄酶五、末端去氧核苷醯轉移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、鹼性磷酸酶十一、

甲基化酶命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血桿菌屬in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：該菌株中第三個被分離到的限制酶同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGG

BglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4連接酶

AGATCC

（連接後的切點均不能被上述兩種酶切）

TCTAGG

一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.三種活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP時）（2）3’外切酶活性（無dNTP時大亞基活性）（3）5’外切核酸酶活性（無dNTP時小亞基活性）2.在基因工程中的應用：缺口平移標記技術。二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亞基，保留大亞基）2.3’外切酶活性（無dNTP時）3.在基因工程中的應用（1）標記粘性末端.

-32P—dNTP

標記平末端

-32P—dNTP（2）將5’端伸出的末端填平（3）可用來反轉錄合成雙鏈cDNA。（4）補平粘性末端。

三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反應四、逆轉錄酶

逆轉錄酶可以RNA為範本，逆轉錄成cDNA第一鏈，又稱依賴RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性

RNA或DNA為範本2.3’外切酶活性能使DNA-RNA雜合鏈中的RNA降解。應用：1.RT-PCR使mRNA逆轉錄成cDNA2.製備探針。五、末端去氧核苷醯轉移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接去氧核糖核苷酸。常用於同種堿基多聚體接尾反應核素標記DNA片段的3’端六、核酸酶S1

可以降解單鏈DNA和RNA(1)將DNA切成平末端。有些限制性內切核酸酶可以將DNA切成粘性末端，經過核酸酶S1降解可切除DNA末端的單鏈。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中單鏈髮夾狀結構。反轉錄反應合成的cDNA，可能形成單鏈髮夾狀結構，為了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成無髮夾結構的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA雜交分子的結構。十、鹼性磷酸酶該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質，將DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，產生5’-OH。應用：(1)用該酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然後加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下標記5’端。

(2)用於避免單酶切後質粒自我環化。十一、

甲基化酶常見的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相應堿基甲基化。dam可在限制酶識別的5′GATC3′或5′GAAT3′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制識別的5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用於使酶切位點中的堿基甲基化而避免降解，保護酶切位點。核酸酶BAL31

從線形DNA分子兩端（粘端/平端）以漸進方式切去單核苷酸，以形成寡聚核苷酸或製造末端缺失。此外也有類似於SI酶單鏈特異降解活性，可除去粘性末端或單鏈髮夾結構。外切核酸酶Ⅲ

能從線性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去單核苷酸，製造3′端缺失，製備DNA範本或特異DNA探針。T4多聚核苷酸激酶能將ATP上的γ位磷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA或RNA的5′-OH上，可將γ-32P-ATP中的32P連接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素標記。二、基因工程的基本程式載體質粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細胞選出含有重組DNA的細胞擴增表達abbAAb第六章

分子克隆常用的載體

第一節

質粒載體第二節

噬菌體載體第三節

真核細胞的克隆載體第一節

質粒載體

一、質粒的基本特性二、質粒的分離純化方法三、質粒載體的選擇四、大腸桿菌質粒載體五、多種功能的衍生質粒的組建一、質粒的基本特性1．質粒及其命名2．質粒的種類3．質粒的複製類型4．質粒的分子生物學特徵二、質粒的分離純化方法1．氯化銫溴乙錠浮密度超速離心密度梯度分離法

（圖3-3）2.Triton和PEG化學提取法3．煮沸裂解菌體，異丙醇沉澱質粒DNA4．堿變性法抽提質粒DNA

質粒的存在形式：呈共價閉合環狀①超螺旋的SC構型（cccDNA）②鬆弛開環的OC型（ocDNA）③鬆弛線性的L構型（cDNA）基本步驟：細菌生長和質粒的擴增菌體收穫和溶菌質粒純化氯化銫浮密度分離法

當各種DNA分子在有飽和溴乙錠染料存在下進行氯化銫密度梯度離心時，與共價閉環狀分子結合的染料要大大少於與開環狀或線狀DNA的結合，因此，在氯化銫梯度離心中質粒DNA與染料相結合後生成的條帶是在較高的密度範圍內，而斷裂為線狀的染色體DNA與溴乙錠結合較多，生成的條帶是低密度範圍。所以，離心後形成2條帶，上面的條帶主要是染色體DNA及少量開環狀質粒DNA，下麵的帶則是共價閉合環狀質粒DNA。

堿變性法抽提質粒DNA

該法也是一種快速抽提質料DNA的方法。其分離原理，大腸桿菌的染色體約有4700KB長，在處理細胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。當溶液的PH調到大於12時雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，於是染色體DNA的雙鏈便分離成單鏈，而超螺旋狀態的質粒DNA僅僅是氫鏈被破壞，並只發生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當PH調回中性時單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質結合生成網路狀大分子，而超螺旋的質粒發生複性反應後仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達到分離的目的。三、質粒載體的選擇

作為理想的質粒載體，應具備以下幾個條件（1）能自主複製，即本身是複製子（2）具有一種或多種限制酶的單一切割位點，並在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的複製功能；（3）在基因組中有1-2個篩選標記，為寄主細胞提供易於檢測的表型特徵，（4）分子量要小，多拷貝，易於操作。四、大腸桿菌質粒載體1．pSC101質粒載體2．pBR322質粒載體分別由pMB1(ori)、pSF2124(Ampr)和pSC101(Tetr)三種質粒通過載體改造後形成，使之具有鬆弛型ori和Ampr及Tetr兩種抗性基因的理想的基因克隆載體。

Ampr

（Scal、PvuI、PstI切點）

Tetr

（EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切點）五、多種功能的衍生質粒的組建

（一）、帶有不同種類抗性基因的質粒載體（二）、高拷貝數質粒pAT153（三）、正選擇質粒（四）、多功能質粒-PUC質粒帶有不同種類抗性基因的質粒載體pBR328是從pBR322改建成的質粒，大小為4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、PvuⅡ和BalI的單一酶切位點。除了pBR328外，pBR325也有類似結構。pAT153是由pBR322質粒改造而成，這種質粒的拷貝數比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,選擇標記有氨苄青黴素抗性基因Ampr和四環素抗性基因Tetr、單一切點的限制性內切核酸酶有PvuⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。正選擇質粒pTR262是正選擇質粒。在這種質粒中，在四環素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌體的PR啟動子，同時在這種載體中還帶有λ噬菌體編碼CI蛋白質（阻遏物）的基因。沒有外源基因插入時，由於CI蛋白質阻遏從PR進行的轉錄作用，因此對四環素不表現抗性。在CI蛋白質基因上有單一的HindⅢ和BclⅠ切點，若利用其中任何一個切點插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白質基因功能喪失，結果PR啟動Tetr基因表達；表現出對四環素的抗性，達到正選擇的效果。第二節

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學特性二、λ噬菌體載體三、粘性質粒四、單鏈DNA噬菌體載體烈性噬菌體溫和噬菌體溶源化細菌溶源化原噬菌體二、λ噬菌體載體（一）λDNA分子(1)λ噬菌體基因結構：如圖3-11、3-12Cos位點（Cohesive-endsite）：λDNA為線狀雙鏈分子，兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環形DNA。這種由粘末端結合形成的雙鏈區段即Cos位點。(2)λ噬菌體DNA的複製（二）λ噬菌體的類型插入型載體替換型載體

(三)λ噬菌體載體的應用1.轉染作用轉染：由宿主細胞捕獲噬菌體或病毒DNA的過程。轉導：以噬菌體為媒介轉移遺傳物質的過程。轉化：質粒等外源DNA引入細胞的過程。2.λDNA的體外包裝（四）常用λ噬菌體凱倫噬菌體載體這類載體有插入型的，如Charon2；也有替換型的，如Charon30。在基因操作中用途很廣。Charon載體上具有適當數量的限制酶切位點，帶有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央區段）。插入基因經包裝後，可通過藍/白斑篩選陽性克隆。Charon載體的特點是容量大，對研究大範圍內的染色體結構很有用處。三、粘性質粒

粘性質粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA順序。經感染進入細菌細胞以後，它就好象質粒那樣在細胞中進行複製。易環化和擴增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用於構建基因文庫。在酵母細胞中常用的載體的共同特點這些載體，它們共同的特點是：（1）能在大腸桿菌中克隆，並且具有較高的拷貝數。這樣可使外源基因轉化到酵母細胞之前先在大腸桿菌中擴增；（2）含有在酵母中便於選擇的遺傳標記。這些標記一般能和大腸桿菌相應的突變體互補，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些還攜帶用於大腸桿菌的抗菌素抗性標記；（3）含有合適的限制酶切位點，以便外源基因的插入。共有三種類型的載體，如圖3-19。第三節

真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的載體（共同特點）

1.整合型載體（YIP）

2.複製型載體（YRP）

3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質粒三、動物細胞基因克隆的載體整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片段構成的。如Pyeleu10是由ColEI質粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構成，在細菌中複製、擴增，進入酵母後可整合表達。YIP型載體的特點是轉化率低(只有1-10轉化子/微克DNA)，但轉化子遺傳性穩定穩定，多用於遺傳分析工作。複製型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標記和複製子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構成的。因為它同時含有大腸桿菌和酵母的自主複製基因，所以能在兩種細胞中存在和複製。可以在兩種截然不同的生物細胞中複製的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），（如圖3-20）穿梭載體在基因工程中廣泛使用。YRP型載體轉化率高，拷貝也高，但不穩定，易丟失。附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質粒、2µm質粒以及酵母染色體的選擇標記構成。2µm質粒含有自主複製起始區（Ori）和STB區,STB序列能夠使質粒在供體細胞中維持穩定。利用2µm質粒，人們已經構建出許多YEP型載體。YEP型載體PYF92（如圖3-21）就是由酵母的2µm質粒、pBR322質粒和酵母的His3+(組氨酸)基因構成的。YEP型載體對酵母具有很高的轉化活性，一般為103-105轉化子/微克DNA。比YRP型載體更穩定，拷貝數也高（25-100個/細胞），是基因克隆中的常用載體。載體載體（Vector）：能攜帶外源基因導入受體細胞，這種運載工具稱載體。1.克隆載體:具組裝、複製、擴增功能。如：pBR322、pUC18/19等。

2.表達載體:不僅具組裝、複製、擴增功能，還有轉錄表達功能。如：pBV220、pKK223-33.載體的種類：質粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動物病毒。共同特徵：①自主複製②易於擴增分離純化③有非必需區④有單一酶切位點（多克隆位點）單一酶切位點：一種酶在一個載體上只有一個酶切位點多克隆位點：一個載體上的某一個區域含有多個單一酶切位點⑤有選擇標記基因⑥表達載體還應有表達調控元件（啟動子、增強子、終止子,SD序列）質粒本質是細菌染色體以外的遺傳物質，是一種簡單的，環狀DNA分子，能自主複製。命名：前一個小寫p代表質粒，後兩個大寫英文字母代表發現者或實驗室，數字代表編號，如pBR322質粒。種類：F質粒：使宿主染色體上的基因通過性菌毛隨其一起轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中。R質粒：抗性因數，攜有一種或多種抗生素抗性基因轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中。Col質粒：有編碼大腸桿菌素基因質粒的類型和特性傳遞類型：①接合型：含有自主轉移基因，使質粒從一個細胞轉移到另一個細胞。如：F質粒、部分R、Col質粒②非接合型：不含有自主轉移基因，質粒不能自主從一個細胞轉移到另一個細胞。如：部分R、Col質粒（安全常用）複製類型：①嚴緊型：低拷貝1-3個拷貝/菌②鬆弛型：高拷貝10-60個拷貝/菌特性：自主複製、轉移、選擇標記遺傳特性、不相容性（同者相斥、異著共存）、分配功能（親代子代）特性：CopA和CopB基因1.複製：負調控

RI質粒：repA基因表達複製PSC101：正調控是由ori複製子向左單向複製2.不相容性；在同一細胞中，同類質粒不能並存的現象。PUC18PUC19分配功能：質粒複製後，隨細胞分裂的進行，質粒分配到子細胞中。Triton和PEG化學提取法Triton和PEG處理法，此法簡單，不用昂貴的氯化銫，不必長時間的超速離心，費用較低，分離效果也很好，此法大體過程如下：培養菌體並加入氯黴素使質粒擴增→離心沉澱菌體。在TE緩衝液中懸浮→加入溶菌酶和去污劑Triton部分裂解菌體→35000r/min離心除去菌體，留上清液→上清液用酚處理除去蛋白質→用乙醇初步沉澱DNA→將DNA懸浮於TE緩衝液中→加聚乙二醇（PEG6000），在4℃下過夜→10000r/min離心15分鐘→DNA沉澱懸浮後再用乙醇沉澱→將DNA沉澱懸浮即得到提純的質粒DNA。煮沸裂解菌體，異丙醇沉澱質粒DNA該法簡便迅速，是實驗室中製備小量質粒DNA時常用的一種方法。將菌液移入1.5ml塑膠管，離心去上清，先用Triton和新鮮配製的溶菌酶處理細胞，100℃加熱60秒種裂解細菌細胞。將裂解液放置冰浴2分鐘，離心5分鐘，根據不同的複性特性，從而去除染色體DNA及細胞碎片。然後用酚氯仿抽提上清去除蛋白質，再加入異丙醇，置於室溫20-30分鐘，離心取沉澱，70%乙醇洗兩次，最後懸浮於TE，即為提純的質粒DNA。根據實驗要求，亦可省去酚：氯仿抽提步驟，使實驗在2小時內完成。多功能質粒-PUC質粒多功能質粒-PUC質粒是由pBR322改建成的帶有LacZ基因的PUC質粒。LacZ上有多克隆位點，插入外源基因後在X-gal平板上使原先的藍斑變成白斑。插入型載體在λimm434區有EcoRI單一酶切位點便於外源DNA插入的稱為插入型載體。λgt10（CI)λgt11(LacZ)若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混濁斑若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ無插入基因IPTG/X-gal平板有藍斑

替換型載體在λNM781/791/762替換型載體的SupE基因中可致使宿主菌lacZ琥珀突變，在該基因中具有成對的EcoRI限制酶位點，在這兩個位點之間的DNA區段可以被插入的外源DNA片段所取代，亦稱取代型載體。由於上述λ噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制,所以能在乳糖麥康基氏(McConkey)瓊脂培養基上產生紅色的噬菌斑,或是在X-gal瓊脂培養基上產生藍色的噬菌斑。但如果supE基因的EcoRI區段被外源DNA所取代，那麼形成的重組體噬菌體只能產生出白色的噬菌斑。可方便地篩選出陽性克隆。如圖3-15單鏈DNA噬菌體載體M13單鏈DNA噬菌體為細線狀DNA，呈單鏈環狀包裝線上狀蛋白外殼中。載體有多聚接頭，可進行LacZ插入失活白斑篩選。可應用於克隆基因，