干细胞片富含血小板血浆磷酸钙颗粒用于骨修复的研究

干细胞片/富含血小板血浆/磷酸钙颗粒用于骨修复的研究背景在临床中因创伤、肿瘤、感染等原因导致的骨折以及骨缺损的重建常常需要外科手段的治疗。在诸多的治疗方法中,自体骨移植仍被认为是骨缺损治疗的金标准。但是自体骨移植存在一些缺点,例如供区组织有限,供体部位发病率,增加患者手术痛苦与风险等。特别是在针对大段骨缺损的修复时,这些问题显得尤为突出,这无疑限制了自体松质骨移植技术在临床中的应用。对于异体骨移植又存在感染外源疾病和引起免疫反应的风险。近年来,随着组织工程研究的兴起,尝试用组织工程的方法来修复骨或重建缺损逐渐成为研究的热点,组织工程是建立在种子细胞、生长因子和生物材料支架三要素基础上的。干细胞具有多向分化潜能,并且在骨组织工程中广泛应用,而骨髓来源的间充质干细胞获取途径简单方便,是良好的种子细胞,此外研究表明干细胞在高密度培养后会形成细胞片层状结构,即干细胞片；生长因子能诱导干细胞定向分化,在应用中可以促进骨缺损的修复,但是生长因子价格昂贵(如BMP-2),寻找能发挥同生长因子效应的药物或自体来源的生长因子具有深远意义,研究表明辛伐他汀可以刺激内源性的细胞分泌BMP-2,而自体来源的富含血小板血浆(PRP)含有多种生长因子；对于生物材料,硫酸钙由于其优良的生物相容性和骨传导性,磷酸钙由于其组成与骨组织一致,两种材料都在骨组织工程中广泛应用,因此在本课题中研究辛伐他汀、PRP对干细胞的作用以及MSC细胞片、载有辛伐他汀的硫酸钙支架、MSC细胞片联合PRP凝胶/纳米磷酸钙在骨组织工程中的应用,从而对其潜在的临床应用价值进行了检测和评估。本课题主要从以下五个方面进行了研究：(1)局部缓慢释放的辛伐他汀/硫酸钙支架在尺骨长段骨缺损再生修复中的应用研究；(2)辛伐他汀对大鼠骨髓来源的间充质干细胞和细胞片的增殖、分化的作用；(3)间充质干细胞片移植促进骨折愈合的应用研究；(4)富含血小板血浆/纳米磷酸钙对间充质干细胞的作用；(5)间充质干细胞片复合富含血小板血浆凝胶/纳米磷酸钙修复骨缺损的研究。第一部分局部缓慢释放的辛伐他汀/硫酸钙支架在尺骨长段骨缺损再生修复中的应用研究目的研究辛伐他汀从载有辛伐他汀的硫酸钙支架的释放及载有辛伐他汀的硫酸钙支架促进骨组织的再生修复作用。方法和结果在体外实验中将0.5mg辛伐他汀与硫酸钙粉末(16.mg和480mg)混合制作成载有辛伐他汀的硫酸钙支架,并测定辛伐他汀的释放曲线,结果显示在第1天辛伐他汀能有效的较大量的从硫酸钙支架中释放,随着时间持续能稳定的释放。体内动物实验：36个完整的1.2厘米的兔尺骨骨缺损分别植入硫酸钙支架、载有辛伐他汀的硫酸钙支架和载有rhBMP-2的硫酸钙支架。术后4和8周行影像学和组织学分析,结果显示载有辛伐他汀的硫酸钙支架和载有rhBMP-2的硫酸钙支架组治疗的骨缺损的X射线评分和新生骨面积明显的高于硫酸钙支架组(P<0.05)。但是载有辛伐他汀的硫酸钙支架和载有rhBMP-2的硫酸钙支架组在X射线评分和新生骨面积无显着性差异(P>0.05)。结论体内局部缓慢释放的辛伐他汀能促进骨组织的再生,而且这种促进骨组织再生的作用与rhBMP-2作用相似,这种载有辛伐他汀的硫酸钙支架在骨组织工程中可能有很大的应用前景。第二部分辛伐他汀对大鼠骨髓来源的间充质干细胞和干细胞片的增殖、分化的作用目的研究辛伐他汀对大鼠骨髓来源的间充质干细胞增殖、分化的影响以及对干细胞片的分化作用方法和结果不同浓度的辛伐他汀与MSCs共培养1、3、7天后MTT检测各种浓度的辛伐他汀对MSCs的增殖影响,当辛伐他汀浓度高于1μM时将会对细胞增殖产生抑制作用,在MTT实验基础上,用0.01μgM、0.1μM、1μM浓度的辛伐他汀与MSCs共培养,另设立未处理MSCs为对照组,3天和7天后检测BMP-2,ALP,OCN,OPG和VEGF等基因表达差异；结果显示辛伐他汀诱导组这些基因的表达量显著高于对照组,而且随着浓度的增高,基因表达量也增加；当MSCs高浓度培养后可以形成细胞片层状结构,1μM辛伐他汀与MSC细胞片共培养7天后,检测BMP-2,ALP,OCN,OPG和VEGF等基因表达情况,另设立未处理MSc细胞片组作为对照组,结果显示：辛伐他汀诱导MSC细胞片组的BMP-2,ALP,OCN,OPG和VEGF等基因表达量显著高于未处理MSC细胞片组。结论低浓度的辛伐他汀能促进MSCs和MSC细胞片的骨向分化和血管发生,这种具有骨向分化和血管发生的MSC细胞片在骨组织工程中将有广阔的应用前景。第三部分骨向分化和血管发生的MSc细胞片促进骨折愈合的应用研究目的辛伐他汀诱导后的具有骨向分化和血管发生的MSC细胞片能加速骨折愈合。方法和结果大鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)高密度培养形成MSC细胞片,然后与1μM辛伐他汀共培养7天后,取下细胞片用于体内移植。20只大鼠,在其胫骨中上段锯断制造骨折模型,用lmm的注射器针头髓内固定,在骨折处用辛伐他汀诱导后的MSC细胞片包裹,未处理组作为空白对照,术后2周和8周进行X线、micro-CT和组织学分析。术后2周和8周MSC细胞片组的X线评分显著高于对照组,组织学和micro-CT显示：术后2周MSC细胞片组的骨折部位部分形成了连接,术后8周形成较好的骨性连接,而对照组纤维组织仍填充骨折处,形成骨不连。结论具有骨向分化和血管发生的MSC细胞片促进骨组织再生,治愈了胫骨骨折。这种方法可能有助于临床中骨折、骨折延迟愈合和骨不连的治疗。第四部分磷酸钙纳米颗粒、富含血小板血浆对大鼠骨髓来源的间充质干细胞的增殖、分化作用目的研究磷酸钙纳米颗粒、富含血小板血浆对大鼠骨髓来源的间充质干细胞增殖、分化的影响。方法和结果制备直径140nm左右的磷酸钙纳米颗粒和从大鼠心脏血中提取富含血小板血浆(PRP)。将不同浓度的磷酸钙纳米颗粒(0.001%,0.01%,0.1%)与MSCs共培养1、3、7天后MTT检测各种浓度的磷酸钙纳米颗粒对MSCs的增殖影响,结果显示磷酸钙纳米颗粒对MSCs的增殖具有浓度依赖性的抑制作用,当磷酸钙纳米颗粒浓度为0.01%,0.1%时会对细胞增殖产生抑制作用,0.001%浓度的磷酸钙纳米颗粒对MSCs增殖无影响；在MTT实验基础上,用0.001%浓度的磷酸钙纳米颗粒或0.001%浓度的磷酸钙纳米颗粒复合PRP与MSCs共培养,另设立MSCs为对照组,7天后检测ALP和OCN基因表达差异；结果显示：磷酸钙纳米颗粒诱导组这些基因的表达量显著高于对照组,茜素红染色显示有骨向分化的钙结节；当PRP(10μL)与磷酸钙颗粒共同与MSCs培养时,磷酸钙纳米颗粒与PRP共同诱导组的这些基因的表达量进一步提高,钙化结节更明显。结论磷酸钙纳米颗粒对MSCs的增殖有浓度依赖性；磷酸钙纳米颗粒能促进MSCs的骨向分化；PRP联合磷酸钙纳米颗粒能协同作用促进MSCs的骨向分化。第五部分间充质干细胞片复合富含血小板血浆凝胶／纳米磷酸钙修复骨缺损的研究目的间充质干细胞片联合富含血小板血浆凝胶／纳米磷酸钙复合物能协同作用促进骨组织再生修复。方法和结果大鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)高密度培养形成MSC细胞片,制备直径140nm左右的磷酸钙纳米颗粒和从大鼠心脏血中提取富含血小板血浆,将10μLPRP、10μL激活剂(含100U/ml牛凝血酶的10%氯化钙溶液)和10mg磷酸钙颗粒同时混合,然后放入37℃培养箱使之反应形成凝胶/颗粒混合物。当MSCs;形成细胞片后,将已经制作好的PRP凝胶/磷酸钙颗粒混合物放到展开的细胞片上,用细胞片包裹混合物后即得到细胞片包裹的PRP凝胶/磷酸钙颗粒混合物；细胞片包裹单独的磷酸钙颗粒为细胞片/磷酸钙颗粒混合物。30只大鼠,在股骨中段做一个2.5×5.0mm的骨缺损,在骨缺损分别植入纳米磷酸钙、PRP凝胶/纳米磷酸钙、MSC细胞片/纳米磷酸钙、MSC细胞片/PRP凝胶/纳米磷酸钙,未处理组作为空白对照,术后4周进行大体观察、X线和组织学分析。另外为了追踪移植的MSc细胞片的存活情况,MSCs首先用CM-Dil标记,然后再培养成MSC细胞片,然后包裹PRP凝胶/纳米磷酸钙植入到另外2只大鼠的4个骨缺损处,术后2周用Maestro动物多光谱影像系统和激光共聚焦进行观察。结果显示：植入的MS