醋酸薄膜电泳

关于醋酸薄膜电泳1、掌握电泳法分离蛋白质的原理2、熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的操作、注意事项3、熟悉测定血清中各种蛋白质相对百分含量的方法4、了解A\G的临床意义实验目的第2页,共33页，2024年2月25日，星期天分离蛋白质的方法分离方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦超速离心法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析第3页,共33页，2024年2月25日，星期天电泳

依据分子或颗粒所带电荷、形状、大小等不同，因而在电场介质中移动速度不同，从而达到分离的技术。

一、电泳第4页,共33页，2024年2月25日，星期天H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI

阴离子，向正极移动阳离子，向负极移动第5页,共33页，2024年2月25日，星期天电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即

V—粒子运动的速度X—电场强度Q—粒子所带电荷r—粒子的半径η—介质的粘度第6页,共33页，2024年2月25日，星期天二、电泳的影响因素

分离样品的性质电泳介质的pH

缓冲液的离子强度电场强度电渗作用第7页,共33页，2024年2月25日，星期天电渗作用

在电场中液体对固体支持物的相对移动.如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。

负极正极－－－－－－－－表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向负极移动

＋＋＋＋＋＋＋＋第8页,共33页，2024年2月25日，星期天三、电泳的分类支持介质不同纸电泳（Paperelectrophorisis）醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）琼脂凝胶电泳（AgarGelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）第9页,共33页，2024年2月25日，星期天支持介质装置形式不同：⑴平板式电泳；

⑵垂直板式电泳；

⑶垂直柱式电泳pH的连续性不同：

连续pH电泳非连续pH电泳第10页,共33页，2024年2月25日，星期天血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳Celluloseacetatemembraneelectrophoresisofserumproteins第11页,共33页，2024年2月25日，星期天

本实验以醋酸纤维膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。醋酸纤维膜是由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中。实验原理第12页,共33页，2024年2月25日，星期天醋酸纤维素较纸电泳的优点电渗作用影响小醋酸纤维素膜对蛋白的吸附小，几乎无“拖尾”。由于醋酸纤维素亲水性小，所容纳的缓冲液也较少，电流大部分是由样品传导，所以分离速度快。醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯第13页,共33页，2024年2月25日，星期天血清蛋白质

清蛋白和球蛋白

清蛋白和α1、α2、β、γ-球蛋白电泳第14页,共33页，2024年2月25日，星期天

血清蛋白的等电点pI大多在7.5以下，在pH为8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点及形状也有差异，在电场中迁移速率不同，可以在醋酸纤维素薄膜上分离成清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、r球蛋白五个区带。预测电泳谱是什么样？第15页,共33页，2024年2月25日，星期天血清蛋白电泳的正常组分

第16页,共33页，2024年2月25日，星期天醋酸纤维膜电泳蛋白组分变化的临床意义（A/G）

可能相关疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*肾病综合症↓↑*↑*肾炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝坏死↓*↑↑↑↑传染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎症/感染后期↑*低

球蛋白血症↓*第17页,共33页，2024年2月25日，星期天

实验步骤一、准备与点样醋酸纤维薄膜电泳装置示意图1、滤纸桥；2、电泳槽；3、醋酸纤维素薄膜；4、电泳槽膜支架；5、电极室中央隔板第18页,共33页，2024年2月25日，星期天镊子取出膜条取一条2.5×8cm的膜条充分浸透在巴比妥缓冲液中滤纸吸去多余的缓冲液无光面距一端1.5cm（大拇指宽）处作点样线点样器下端粘上薄层血清垂直点样

加样时一定要呈直线，垂直分布均匀，这样泳动的区带整齐不歪。第19页,共33页，2024年2月25日，星期天放置膜条平衡5分钟通电关闭电源点样面向下点样端置于阴极膜条贴紧滤纸，拉直膜条电压：120v/160v时间：10min/50min二、电泳点样线勿与滤纸桥接触

通电后，不要用手或镊子接触电泳槽，通电完毕，先切断电源，以防触电。第20页,共33页，2024年2月25日，星期天第21页,共33页，2024年2月25日，星期天通电完毕浸于染色液（氨基黑10B）中取出膜条三、染色、脱色取出膜条3min依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ滤纸吸干薄膜各5min直至漂净第22页,共33页，2024年2月25日，星期天白蛋白α1球蛋白β球蛋白α2球蛋白点样线Γ球蛋白第23页,共33页，2024年2月25日，星期天取试管6支，编号如下四、定量(两人的膜条共用)

试管编号

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH

6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白条带清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白无蛋白区

充分振荡、脱净染料比色650nm、定量15min第24页,共33页，2024年2月25日，星期天

原始数据：清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白A

表1血清各蛋白质吸光值仪器型号：吸收波长：实验时间：第25页,共33页，2024年2月25日，星期天实验结果

1．计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。

清蛋白％＝（2A/∑T）×100％ α1球蛋白％＝（α1/∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2/∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/∑T）×100％光密度总和T＝2A+α1＋α2

＋β＋γ2．计算出清蛋白与球蛋白之比值（A/G）

G=α1＋α2＋β＋γ第26页,共33页，2024年2月25日，星期天注意事项1.点样面为不光滑面，勿用手触摸感知；2.点样量适中，垂直点样；3.点样端接电泳仪负极；4.膜条与滤纸需贴紧，拉直；5.谨防触电。第27页,共33页，2024年2月25日，星期天1、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？2、电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成分？请分析原因。3、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？实验思考讨论第28页,共33页，2024年2月25日，星期天1.蛋白质的理化性质？2.蛋白质的盐析？3.蛋白质的显色反应有哪些？4.分离蛋白质的方法有哪些？5.层析技术的分类及各自的原理。6.透析的原理？实验四血清γ-球蛋白的提纯第29页,共33页，2024年2月25日，星期天第30页,共33页，2024年2月25日，星期天待分离大分子的性质

所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。

pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大。pH过高或过低会引起蛋白质变性。电泳介质的pH第31页,共33页，2024年2月25日，星期天缓冲液的