五氯酚污染土壤的堆肥修复及其微生物群落组成研究

五氯酚污染土壤的堆肥修复及其微生物群落组成研究本文采用农业废物好氧堆肥化处理方式以及添加堆肥的处理方式研究了其对五氯酚污染土壤的生物修复过程。实验选用多种理化参数、生化参数以及微生物学参数评价了土壤中的五氯酚对好氧堆肥化进程、堆肥腐熟度以及微生物群落组成的影响；基于这一研究结果,对比考察了在堆肥化的两次不同发酵阶段接种P.chrysosporium修复五氯酚污染土壤的效果,以及其对堆肥中与五氯酚降解有关的胞外木质素降解酶的活性及堆肥中微生物群落组成的影响；最后以腐熟的堆肥以及接种有P.chrysosporium的堆肥作为生物添加材料,研究了采用生物添加法对五氯酚污染土壤的生物修复效果和对土壤中微生物活性的影响。实验选用农业废物稻草秸秆、菜叶、麸皮和土壤作为堆肥原料,设置了含浓度为133mg/kg的五氯酚污染土壤和未受五氯酚污染土壤的2个堆肥体系。经过60d的堆肥化处理结果表明土壤中五氯酚的降解率达到了72.3%,堆肥微生物明显影响了五氯酚的降解速率。通过检测2个堆体的温度、pH、有机质含量等多个堆肥参数,发现五氯酚污染土壤的存在对堆肥化进程产生了明显的影响,并且在堆肥过程的中温期和高温期尤为显著。基于堆肥所有物化和生化参数的聚类分析也阐明了2个堆体堆肥化进程的区别,而堆肥温度是解释这种差异最相关的参数。此外,用碳氮比(C／N)、水溶性有机碳(WSC)、脱氢酶(DH-ase)活性和种子发芽指数(GI)综合评价了堆肥的腐熟度,研究发现五氯酚的存在也对腐熟度评价参数的影响较大。在五氯酚污染土壤的堆肥化处理过程中,堆肥的腐熟度和稳定度受污染影响较大,从而使堆肥达到腐熟的时间延长,堆肥质量降低。因此,尽管采用堆肥化处理能够实现五氯酚污染土壤的生物修复的目的,但是堆肥需要更长的腐熟时间才能达到好的生物修复效果。同时,基于分子生物学方法中的PCR-DGGE技术考察了堆肥化生物修复过程中2个堆体微生物群落组成的变化情况。实验从不同时间获得的堆肥样品中提取微生物的总DNA,并选择细菌特异性引物对GC-338F/518R和真菌特异性引物对NS1/GC-Fung分别进行PCR扩增,获得了堆肥中细菌和真菌群落组成的DGGE图谱。经过图谱分析以及相关数据的主成分分析(PCA)发现土壤中的五氯酚对堆肥中微生物群落的演替具有较大的影响。在五氯酚污染的胁迫作用下堆肥中的细菌群落和真菌群落组成发生改变。其中,五氯酚对堆肥细菌群落的影响主要表现在堆肥化过程的高温期,此时2个不同堆体中细菌群落组成差异极其显著,但随着堆肥化的进行细菌群落组成开始变得逐渐相同,尤其当堆肥达到腐熟时2个堆体中相同的细菌群落组成可以考虑作为评价堆肥腐熟的一项微生物学指标。与细菌群落的变化相比,堆肥中的真菌的丰度、群落组成由于受五氯酚的浓度影响较大,在其胁迫作用下真菌群落的演替趋势随着堆肥化的进行变化显著,直到堆肥达到腐熟时,2个堆体中真菌群落组成的差异仍然存在。这也表明在五氯酚污染土壤的堆肥化修复过程中,真菌群落对于评价五氯酚的污染程度比细菌群落更加有效。本研究另外设计了3个五氯酚污染土壤的农业废物堆肥化处理体系,通过在堆肥化过程的两次不同发酵阶段接种P.chrysosporium,以期能够进一步提高堆肥化生物修复五氯酚污染土壤的效率。实验结果表明,两次不同发酵阶段的接种方式能够明显促进土壤中五氯酚的降解,使60d五氯酚总的去除率分别达到88.6%(RunB)和97.5%(RunC),并能使堆肥提前达到腐熟。其中在堆肥二次发酵阶段接种P.chrysosporium比在堆肥一次发酵阶段接种对五氯酚的降解效果以及对堆肥腐熟的促进程度更加明显,这表明2种不同的接种方式对五氯酚污染土壤的堆肥修复效率取决于接种时间。尽管接种P.chrysosporium明显增强了堆肥中与五氯酚降解有关的孢外木质素降解酶木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)的活性,但是结果也发现几种酶并不是促使土壤中五氯酚降解最为关键的因素。而基于PCR-DGGE方法的研究结果也表明,在堆肥的不同发酵阶段接种P.chrysosporium能够明显影响细菌群落的丰度及其群落组成,这种影响在二次发酵阶段接种的堆体中(RunC)表现地更加突出,认为微生物群落组成的改变可能是促使五氯酚迅速降解和堆肥化修复效率显著提高的主要原因。堆肥是堆肥化过程的终产物,利用堆肥作为生物添加材料通常能够增加土壤有机质的含量以及微生物的活性,改善土壤的结构和功能。研究添加堆肥或者添加堆肥+接种P.chrysosporium的处理方法对五氯酚污染土壤的生物修复过程,结果发现土壤中五氯酚的浓度随着处理时间的延长逐渐降低。通过从土壤的3种腐殖质组分中提取到的五氯酚的浓度表明,五氯酚在土壤中的消失与土壤的有机物质含量密切相关,添加堆肥的处理方式(CS50)增加了土壤中的有机质含量,从而使土壤中被提取出的五氯酚浓度降低。在添加堆肥+接种P.chrysosporium的处理体系中(CPS50)提取到的五氯酚是所有处理体系中浓度最低的,表明接种P.chrysosporium能够降解或转化被土壤有机物质吸附的五氯酚,使五氯酚污染土壤达到了更好的生物修复效果。而且,研究还发现2种不同的生物添加处