佛手散化学成分分析及其抗脑缺血作用的研究

佛手散化学成分分析及其抗脑缺血作用的研究佛手散,又名芎劳汤,出自宋·许叔微《普济本事方》卷十,由当归和川芎两味中药组成,既是古方,又是一著名药对。该方组方精良,配伍严谨,具有活血化瘀、气血兼顾、祛风止痛之功效。古时主治妇女月经不调、胎前产后血虚头晕、头痛,心腹诸痛等病证。现代药理研究发现该方具有抗血小板聚集、抑制血管平滑肌增生、改善血液循环、抗脑缺血及抗氧化等多种功效。近年临床上多用于治疗脑中风、脑动脉硬化、深静脉血栓等心脑血管疾病,疗效确切。尽管佛手散及其单味药、有效成分等已在临床上得到了广泛的应用,组方单味药当归和川芎的物质基础研究也取得了相当的进展,但从方剂整体水平上研究佛手散的化学物质基础、抗脑缺血的药理作用却鲜有报道。本课题以佛手散水煎剂为研究对象,建立其指纹图谱分析方法及指标成分测定方法,从定性定量的角度检测佛手散水煎剂的内在质量,获得汤剂中所含的化学成分信息。结合体内和体外不同层次的脑缺血损伤模型,分别从整体动物和细胞两个水平上研究佛手散水煎剂对缺血性脑损伤的保护作用,在此基础上,进一步对复方佛手散全方及不同萃取部位进行体外抗脑缺血药效筛选实验,探讨其抗脑缺血的有效部位及有效成分。采用优选的水提工艺对佛手散水煎剂进行制备,以10批佛手散水煎剂样品为研究对象,运用HPLC法建立该方水煎剂指纹图谱,利用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”软件对10批样品的相似度进行评价,建立佛手散水煎剂指纹图谱的共有模式,测得各批次样品与共有模式的相似度,结果表明各批样品中共有峰的相对保留时间基本一致,RSD均小于1%,相似度均大于0.94,符合中药指纹图谱的技术要求,所建立的共有模式能较好地反映出全方化学成分质与量的分布情况,并通过复方与组方药味指纹图谱的相关性分析,对其化学物质组成进行初步表征,研究结果可为该方的质量控制和化学物质基础研究提供参考依据。在此基础上应用超高效液相色谱-电喷雾-质谱(UPLC-ESI-MS)技术对佛手散的化学成分进行了定性鉴别,通过对质谱和光谱数据的解析,结合部分对照品和参考文献的比对,对标定的16个色谱峰进行了分析鉴定,成功鉴定了其中的11个组分,分别是绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、川芎酚、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、丁烯基苯酞、丁基苯酞、洋川芎内酯A、藁本内酯以及邻苯二甲酸二丁酯,初步明确了佛手散水煎剂的主要化学物质基础。据文献报道,阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A和藁本内酯被证实是对心脑血管发挥作用的有效成分,因此本研究运用UPLC法首次建立了佛手散水煎剂中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A及藁本内酯4种有效成分的含量测定方法。结果表明该方法操作简便、精密度高,可为其质量控制提供科学依据。为进一步确证佛手散抗缺血性脑损伤的疗效,本研究结合体内和体外不同层次的脑缺血损伤模型,分别从整体动物和细胞两个水平上研究该方汤剂对缺血性脑损伤的保护作用。首先采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血再灌注(middlecerebralarteyocclusion,MCAO)模型,从整体动物水平上考察佛手散水煎剂对实验性脑缺血损伤的保护作用,结果显示,佛手散对实验性脑缺血所致的大鼠神经行为学障碍、脑水肿程度以及脑梗死体积均有明显的改善作用,且作用呈剂量依赖性,表明佛手散水煎剂对脑缺血再灌注损伤具有良好的保护作用,其机制可能通过增加脑组织中抗氧化酶活力、降低脂质过氧化反应等发挥效应。此外,本研究采用连二亚硫酸钠合并缺糖建立体外PC12细胞氧糖剥夺(oxygen-glucosedepriviation,OGD)损伤模型,从细胞水平上考察该方对PC12神经细胞缺氧缺糖损伤的保护作用,结果显示,相比于模型组,佛手散水煎剂预处理组对缺氧缺糖诱导的细胞损伤具有明显的保护作用,可剂量依赖性的减少细胞中MDA和NO含量,提高SOD活性,此可能是佛手散水煎剂发挥神经保护作用的机制之一。在体内外实验证实佛手散水煎剂具有抗脑缺血作用的基础上,本课题借助传统植化手段,采用不同溶剂对佛手散全方进行梯度萃取,分别得到乙酸乙酯、正丁醇和残余水三个萃取部位,通过UPLC指纹图谱对不同部位的化学成分进行表征,同时以体外培养的PC12细胞建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型,直接在细胞水平上考察佛手散各部位对神经细胞缺血样损伤的影响,以筛选佛手散水煎剂抗脑缺血的有效部位及有效成分。药效筛选结果表明乙酸乙酯部位对PC12细胞OGD损伤的抑制作用较强,抑制率大于50%,与全方组药效相近；残余水部位的抑制作用次之；而正丁醇部位的抑制作用不明显。推测乙酸乙酯部位和残余水部位为佛手散抗缺血性脑损伤的有效部位,其药效成分可能主要集中于上述两个部位。综合前期UPLC-ESI-MS分析结果,乙酸乙酯部位主要是阿魏酸和咖啡酸以及洋川芎内酯A、H、I、丁基苯酞、丁烯基苯酞、藁本内酯等苯酞类化合物。据此推测上述化合物可能是佛手散水煎剂抗脑缺血的