(全国百强校)江西上高第二中学高三二轮练习生物资料：血红蛋白的提取和分离

课题3血红蛋白的提取和分离罗军辉思考蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，多数由多糖类构成：如葡聚糖、琼脂糖）

2、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对

的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

，而

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快相对分子质量较小4、具体过程（二）缓冲溶液

1、概念在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变2、作用3、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)（三）电泳：1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离3、类型琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4、实例由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量①应用②聚丙稀酰胺凝胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素③原理④SDS作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小⑤SDS作用机理二、实验操作样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤血液组成操作过程血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a-肽链两个β-肽链四个亚铁红素基团①成分｛｛｛｛｛四个亚铁红素基团两个a-肽链两个β-肽链每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色②组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白③选材1、红细胞的洗涤①洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化②洗涤操作A、采集血样B、低速短时间离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）（二）样品处理C、吸出血浆：上层透明的黄色血浆；将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤，搅拌E、低速离心（低速短时间）F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。洗涤次数不可过少,过少无法除去血浆蛋白。2.血红蛋白的释放加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白3.分离血红蛋白溶液①过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）②试管中溶液层次用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体③分离取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时方法：透析除去样品中分子量较小的杂质操作：透析目的:（二）粗分离（三）纯化方法：凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：⑤安装其他附属结构③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体2凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果注意：2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时④洗涤平衡3样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口③样品渗入凝胶床④洗脱加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能⑥注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观