腐霉属的DNA条形码和分子系统学研究

腐霉属的DNA条形码和分子系统学研究腐霉(Pythium)是世界性分布的一类菌物,大多数物种腐生于土壤、水和动植物残体中,有些物种是动植物的重要病原菌。中国幅员辽阔,多样的生态环境蕴藏着丰富的腐霉资源。本文以从我国不同植物根际土壤中分离的腐霉菌株和从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)收集到的腐霉菌株为材料,开展了腐霉属的分类学、DNA条形码及分子系统学研究,并应用筛选到的DNA条形码对广西草坪腐霉的群落组成与物种多样性进行系统调查。主要取得如下结果：1、根据形态特征与COI(细胞色素C氧化酶第1亚基基因)和ITS序列分析,将分离和收集的525株腐霉菌鉴定为51个分类单元,其中包括已发表的5个新种：田野腐霉(Pythiumagreste)、百色腐霉(P.baisense)、短枝腐霉(P.breve)、广西腐霉(P.guangxiense)和武汉腐霉(P.wuhanense),12个中国新记录种：引雄腐霉(P.attrantheridium)、钟形腐霉(P.campanulatum)、囊形腐霉(P.folliculosum)、长囊腐霉(P.longisporangium)、卵突腐霉(P.oopapillum)、满器腐霉(P.pleroticum)、多卵腐霉(P.plurisporium)、固执腐霉(P.recalcitrans)、稻根腐霉(P.rhizo-oryzae)、高山腐霉(P.takayamanum)、土栖腐霉(P.terrestris)和姜腐霉(P.zingiberis),还有10个待发表的疑似新种。2、从4个DNA片段即COI、COII(细胞色素C氧化酶第2亚基基因)、ITS和β-tub(Beta-微管蛋白基因)中筛选腐霉的条形码。综合PCR和测序成功率两项指标,获得DNA片段的容易程度从高到低的排序为COII(100%)>COI(97.1%)>ITS(83.1%)>β-tub(68.7%).COI(平均种内相似率,简称AS=0.993)的种内相似水平接近COII(AS=0.994)和ITS(AS=0.993).但低于β-tub(AS=0.996),而COI(平均种间相似率,简称ASi=0.921)的种间相似水平接近CoII(ASi=0.912)、但高于ITS(ASi=0.627)和β-tub(ASi=0.881)。COI和COII序列的种内和种间相似率之间有一条相对清晰的分界线,而ITS和β-tub序列的种内和种间相似率之间重叠严重。对于本研究的51个腐霉分类单元,4个备选DNA片段都不能区分的为P.folliculosum与簇囊腐霉(P.torulosum)以及P.guangxiense与周雄腐霉(P.periilum),COI和β-tub不能区分的为群结腐霉(P.myriotylum)与P.zingiberis,COII和ITS不能区分的为异丝腐霉(P.diclinum)与宽雄腐霉(P.dissotocum),ITS和β-tub不能区分的为寡雄腐霉(P.oligandrum)与疑似新种Pythiumsp.nov.4,ITS不能区分开的为P.folliculosum、P.torulosum与P.rhizo-oryzae以及刺腐霉(P.spinosum)与疑似新种Pythiumsp.nov.7,B-tub不能区分开的为P.spinosum与疑似新种Pythiumsp.nov.6以及林栖腐霉(P.sylvaticum)、疑似新种Pythiumsp.nov.9与P.terrestris,因此,COI、COII、ITS和β-tub等4个DNA片段对腐霉物种识别率从高到低的顺序为COI(88.2%)=COII(88.2%)>ITS(78.4%)>β-tub(74.5%)。初步研究结果表明,COI和COII对腐霉属的识别效果比ITS和β-tub更好,由于目前公用分子数据库中腐霉属COII序列数据所涉及到的物种还非常有限,COI序列数据相对丰富,因此,建议把COI作为腐霉的主要条形码,COII作为腐霉的辅助条形码。3、单基因和多基因系统发育分析结果显示,ITS、ITS与COI联合以及COI、COII、ITS和β-tub四片段联合都能反映出腐霉属的系统演化关系。经过对比发现,四基因结合系统树上的主要进化分枝与形态特征的对应关系最好,该系统树根据进化分枝的演化关系将腐霉的孢子囊清晰地划分为三种类型：丝状或丝状与球形结构组成的复合体孢子囊类型、串生球形或肿囊状与球形结构组成的复合体孢子囊类型以及单生球形孢子囊类型。其中串生球形或肿囊状与球形结构组成的复合体孢子囊类型处于丝状或丝状与球形结构组成的复合体孢子囊类型和单生球形孢子囊类型之间,这种类型是两者之间的过渡阶段。传统上,在分类检索表中作为区别腐霉属物种的有性繁殖体的形态特征与各分子系统发育树上的大进化枝没有明显的对应关系。4、以COI作为主要条形码对从广西草坪土壤中分离到的122个腐霉菌株进行分子鉴定得到24个分类单元。广西草坪腐霉的群落组成与多样性分析结果表明,季节对腐霉的物种丰度(F=8.945,P=0.000)和Shannon’s多样性指数(F=4.599,P=0.004)有极显著影响,其中物种丰度在冬季(1.10±0.18)显著高于夏季(0.43±0.12)和秋季(0.20±0.10),春季(0.80±0.15)显著高于秋季(0.20±0.10)；Shannon’s多样性指数在冬季(0.26±0.07)显著高于秋季(0.04±0.03)和夏季(0.03±0.03)。同样地理位置对腐霉的物种丰度(F=3.087,P=0.013)也有显著影响,其中桂林的物种丰度(1.00±0.22)显著高于北海(0.15±0.0