植物转录因子转录活性分析系统开发及验证

摘要`

转录因子对很多下游基因的表达具有调控作用,在植物的生长发育、代谢及抵抗生物和非生物胁迫为中起着重要作用。随着全球环境的恶化以及人口增长的压力，植物抗逆机制和植物抗逆性的研究对于可持续发展的现代农业来说是至关重要的。植物经过长期的自然选择，不断进化以适应外界环境的变化，形成了对各种环境胁迫的适应性或抗逆能力。植物体通过感受环境胁迫信号，通过多种信号转导途径，诱导一系列相关基因的表达，参与响应胁迫反应，调节体内生理生化代谢，形成抗逆防御反应体系，以抵御环境胁迫对植物体的伤害。转录因子是一类能够与启动子区域顺式作用元件特异性结合的蛋白质，是植物中最大的基因家族之一。本实验通过构建携带GAL4顺式元件(GAL-UAS)双荧光素酶报告子载体和GAL4BD(GAL4的DNABinding结构域)融合表达目的转录因子(已知具有转录抑制活性的OsMADS57和转录激活活性的OsDRAP1)的效应子载体，通过农杆菌介导的烟草瞬时转化体系对该系统进行验证，明确转录因子转录活性分析系统的灵敏性。研究结果将为进一步探究候选基因（转录因子）的生物学功能、转录调节机制研究提供技术支撑。关键词：植物；转录因子；双荧光素酶；转录活性；GAL4

AbstractTranscriptionfactorsplayaregulatoryroleintheexpressionofmanydownstreamgenesandplayanimportantroleinplantgrowth,metabolismandresistancetobiologicalandabioticstress.Withthedeteriorationoftheglobalenvironmentandthepressureofpopulationgrowth,thestudyofplantresistancemechanismandplantresistanceisveryimportantforsustainablemodernagriculture.Plantshaveevolvedoveralongperiodoftimetoadapttochangesintheexternalenvironment,forminganadaptableorresistantabilitytovariousenvironmentalstress.Byfeelingthesignalofenvironmentalstress,throughavarietyofsignaltransductionchannels,theplantbodyinducestheexpressionofaseriesofrelatedgenes,participatesintheresponsetothestressresponse,regulatesthephysiologicalandbiochemicalmetabolisminthebody,andformsananti-reversaldefensiveresponsesystemtoresistthedamagetotheplantbodybyenvironmentalstress.Transcriptionfactorisisaclassofproteinsthatcanbindspecificallytotheco-actingelementsofthepromoterregionandisoneofthelargestgenefamiliesinplants.ThisexperimentverifiedthesystembyconstructinganeffectsubcarrierthatcarriesGAL4-cherokinenzymereportingsubcarriersandGAL4BD(THEDNABindingdomainofGAL4)fusionexpressionpurposetranscriptionfactors(OsMADS57knowntohavetranscriptioninhibitionactivityandosDRAP1withtranscriptionalactivationactivity)toverifythesystemthroughtheagriculturalbacteria-mediatedtobaccotransientconversionsystem.Theresultswillprovidetechnicalsupportforfurtherexplorationofthebiologicalfunctionofcandidategenes(transcriptionfactors)andthestudyoftranscriptionalchemymechanisms.Keywords:Plants;transcriptionfactors;difluoroenzyme;transcriptionactivity;GAL4绪论1.1植物响应非生物胁迫反应旱涝、盐渍、高低温影响了植物的生长发育，这些非生物胁迫在自然环境中非常常见，造成了农作物产量下降。由于植物固定的生长在一个地方，不能移动，在长期进化过程中，为了避免这些恶劣胁迫，为了适应各种各样的环境条件，植物从分子、细胞、生理生化等方面形成相应的抵抗机制(黄立钰，2010)。1.1.1非生物胁迫对植物的影响土壤盐渍化是导致作物减产的重要影响因素之一，受到人们越来越多的重视。在盐协迫情况下，植物的形态发育受到影响，表现为抑制组织和器官的生长，加速发育过程，缩短营养生长和开花期，盐协迫也影响植物生理生化代谢，表现为植物细胞脱水，膜系统破坏，位于膜上的酶功能紊乱，各种代谢无序进行最终导致膜透性的改变，表现为组织因缺水而引起气孔关闭、叶绿体受损，与光合作用相关酶失活或变性，光合速度下降，同化物合成减少，表现为呼吸作用先加强而后减弱；表现为加速贮藏蛋白质的水解产生有害物质，使植物细胞受到毒害，盐协迫对植物造成的伤害是由于离子协迫和渗透协迫引起的。不同激素在植物体内的含量会随着逆境胁迫而发生不同程度的变化。作为一种逆境胁迫激素，ABA在植物体内的含量会随着盐胁迫的处理而相应的变化，其下游信号通路也会随之改变(宿明星等，2015）。干旱胁迫和水涝胁迫是水分胁迫的两种表现形式（杨映雪，2013）。水分缺失造成的胁迫称为干旱胁迫。生长缓慢是植物体在干旱的环境条件下表现出的现象，在干旱环境下，植物为了生存，叶片数量和叶片面积会显著减少，生物量在植物体内的合成含量也会随着干旱胁迫而变化。由于植物体内水分过多而引起的胁迫叫水涝胁迫。与前面盐胁迫相类似，细胞的膜结构破坏，对光合作用的影响，同时还会造成植物根部缺氧是水涝胁迫对植物的主要危害，它会打破植物体内在的平衡状态，自由基的大量积累加速植物衰老。水涝胁迫还会导致光合速率降低但光呼吸作用加强。有害物质的过多积累限制植物的生长。同时植物根部对矿质元素的吸收能力下降。植物体内的激素乙烯和ABA含量在干旱胁迫和水涝胁迫的情况下都是增加的（李娟等，2019）。温度对植物的生长发育起着关键作用（刘燕敏等，2018）。其中高温和低温胁迫是温度胁迫的两种形式，通过观察温度高于零度或低于零度可以把低温胁迫分为冷胁迫和冰冻胁迫。植物细胞膜的完整性受到温度的影响，过高或过低的温度都会破坏植物体细胞膜。另外，线粒体和高尔基体等细胞器也受其影响。细胞膜所具有的选择性吸收的能力会丧失，受胁迫影响程度可根据相对电导率的数值来判断。在温度低于零度以下时，会导致细胞内结冰,毒害物质的积累增加，蛋白质等生物大分子的结构和功能受损，在植物光合作用中的过程中，植物对温度的感知是比较敏感的，温度胁迫会致使相关酶活性受到影响，导致净光合速率减弱。另外，呼吸代谢过程中酶的钝化也受温度的影响，成为植物生长中的不利作用（张丹等，2019）。1.2植物转录因子的研究概况转录因子(transcriptionfactor,TF)是能与位于转录起始位点上游50~5000bp的顺式作用元件、增强子或沉默子结合来激活或者抑制目的基因表达的蛋白质（王传琦等，2013；樊松乐等，2019）。转录因子的结构包括DNA结合区(DNA-bindingdomain)、转录调控区(transcriptionregulationdomain)、寡聚化位点(oligomerizationsite)、核定位信号(nuclearlocalizationsingal,NLS)（刘强等，2000），转录因子至少由两个结构域组成，DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录调控结构域(Transcriptionregulationdomain)。DNA结合结构域特异性结合顺式作用元件，转录调控结构域激活或抑制靶基因表达。它们共同调节靶基因的转录起始速率和植物的生长发育、代谢等过程（刘相莲等，2017）。1.2.1植物转录因子的类型NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是植物特有的最大的转录因子家族之一，具有独特的结构特征，由保守的N端结构域和多变的C端转录激活域组成。9大多数NAC蛋白具有保守的DNA结合结构域，其大约150个氨基酸位于蛋白质的N末端，并且在C末端区域具有高度可变的转录调节区域（张慧珍等，2019；王芳等，2019）。bHLH转录因子因含有bHLH结构域而得名。bHLH结构域由50~60个氨基酸组成，可分为长度为10~15个氨基酸的碱性氨基酸区和40个氨基酸左右的α-螺旋-环-α-螺旋区(HLH区)。碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N-端，具有DNA识别和结合位点。植物中50%以上的碱性氨基酸区含有高度保守的H5-E9-R13序列(His5-Glu9-Arg13)，其对bHLH和靶标DNA的结合必不可缺（AtchleyWRetal.,1997;AmoutziasGDetal.,2004;StevensJDetal.,2008;PiresNetal.,2010）MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一，约占拟南芥总转录因子家族的9%16MYB类转录因子的得名是因其结构上都有一段保守的DNA结合区，即MYB结构域。MYB转录因子结构域的N端区域都是高度保守的，且该结构域由1-3个串联的且不完全重复的R结构(R1,R2和R3)组成。R结构是由50个左右的氨基酸组成的折叠蛋白，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列，其中氨基酸残基以螺旋-转角-螺旋(HTH)的形式参与到与DNA的结合过程间隔序列则由一个色氨酸残基组成，每隔18个氨基酸会间隔着一个色氨酸残基，这个色氨酸起着疏水核心的作用，对维持HTH的构型具有重要意义(OgataKetal.,1995;LipsickJ.S.,1996;冯盼盼等，2016)。植物AP/ERF转录因子超家族是一个庞大的转录因子家族，其蛋白质序列中含有1或2段由60~70个氨基酸残基组成的AP2/ERF结构域18。依据AP2/ERF结构域数的不同，可以将AP2/ERF类转录因子分成4个亚族:DREB(dehydration-responsiveelementbindingprotein)、ERF(Ethylene-responsiveelementbindingfactors)、AP2(APETALA2)、RAV(relatedtoABI3/VP1)4个亚族，DREB亚族和ERF亚族仅含1个AP2/ERF结构域，AP2亚族含有2个AP2/ERF结构域，而RAV亚族除了含有1个AP2/ERF结构域之外还含有1个B3结构域(SakumaYetal.,2002)。1.3植物转录因子转录活性技术体系研究进展目前对于植物转录因子转录活性的研究主要是酵母激活系统。酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)是1989年由Field提出并建立(FieldsSetal.,1989)。它是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统，是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular)，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域(activationdomain，DNA-AD)。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列(UAS)的下游启动子，使启动子下游基因得到表达。在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重组体中LacZ基因的表达。随着酵母双杂交系统的应用与完善，li等1993年提出了酵母单杂交技术(LIJJetal.,1993)通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白质之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因的表达与调控，由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性作用的敏感性，现在已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的转录因子。1.4研究目的及意义目前利用酵母激活系统仅能对转录因子的转录激活功能进行分析，尚还缺乏对于植物体内转录因子的转录抑制活性方面的研究。本实验将酵母转录活性研究体系与双荧光素酶报告系统融合，开发一套通用的植物体内转录因子活性分析体系。2材料和方法2.1实验材料2.1.1供试植物供试材料为水稻品种‘日本晴’(OryzasativaL.，cv.Nipponbare)。将水稻种子用水培装置培养，待长到两叶一心时取适量水稻叶片，用ddH2O冲洗干净后放入液氮中速冻，再放入-80℃冰箱保存。2.1.2主要仪器与设备PCR仪、超净工作台、摇床、酶标仪2.1.3主要试剂及溶液配制YEP培养基配方：表1YEP培养基配方成分名称用量（/L）牛肉浸膏10g酵母提取液10gNaCl5gPH7.0重悬液配方：表2重悬液配方成分名称用量（/L）MgCl210mmolMES10mmolPH5.62.2RNA提取和cDNA合成水稻叶片总RNA提取根据OMEGA公司的PlantRNAKit(R6827-01)的方法进行，采用NanoDropOne进行纯度和浓度检测，RNA置于-80℃冰箱保存。总RNA反转录第－链cDNA参照TIANGEN公司的快速反转录试剂盒(Cat#KR116-02)的方法进行，20μl的cDNA稀释至100μl，置于-80℃冰箱保存备用。2.3双荧光素酶报告子载体的构建合成GAL4顺式元件序列GAL-UAS和35Sminimal(含TATAbox)序列(Brametal.,1985;Elliottetal.,2008;Vasheeetal.,1993,Liuetal.,1994;Ulmasovetal.,1995,1997a,1997b,1999a1999b)，用限制性内切酶KpnI和SpeI进行酶切消化后插入到pGreenII0800荧素酶报告基因(LUC)前，完成双荧光素酶报告子载体的构建，命名为pGreenII0800-GAL。2.4效应子载体构建所有的效应基因都由CaMV35S(2×)启动子控制(Skuzeskietal.,1990)，并包含3’胭脂氨酸合成酶未翻译区(Liuetal.,1994;Ulmasovetal.,1995)。克隆GAL4的DNA结合结构域(GAL4-BD,aminoacids1to147)(Tiwarietal.,2001)，用限制性内切酶AscI和KpnI进行酶切消化后插入到pMDC43(Curtisetal.,2003)的多克隆位点，替换pMDC43的GFP片段(命名为pMDC43-GAL4/BD)，转化大肠杆菌DB3.1，挑取单克隆进行菌液PCR检测，阳性克隆送往擎科生物技术有限公司测序。2.5转录因子转录活性系统的验证根据基因序列，用PrimerPremier5.0软件设计引物TA克隆已知转录因子(OsMADS57具抑制活性)和OsDRAP1(具激活活性)编码区序列，构建到中间载体pGWC-T(Chenetal.,2006)上，然后利用Gateway技术将编码区序列插入pMDC43-GAL4/BD，使目的基因与GAL4-BD融合(命名为pMDC43-GAL4/BD-OsMADS57和pMDC43-GAL4/BD-OsDRAP1)。构建成功的重组质粒送往擎科生物技术有限公司测序。将测序正确的重组质粒(pGreen0800II-GAL和pMDC43-GAL4/BD-OsMADS57、pMDC43-GAL4/BD-OsDRAP1)采用热激法分别转入农杆菌EHA105中，在含有利福平和卡那霉素的YEP培养基上筛选，挑取阳性克隆，扩大培养至30mL液体YEP培养基中，至OD600=1.5；室温,5000g离心10min，弃掉上清液，用重悬液(10mmol•L-1MgCl2，10mmol•L-1MES，pH5.6；高温高压灭菌后，加100μmol•L-1乙酰丁香酮)重悬菌体，至OD600=1.0，室温放置2~3h。报告菌株或单独培养，或与效应菌株混合培养(报告菌株:效应比为1:9或2:8)。将农杆菌悬液置于10毫升注射器中，用手小心按压渗透到生长1月左右的健康的烟草叶片下表面。将注射后的烟草置于黑暗中24h，植物入渗后留置3天。根据制造商的指示(Promega)，采集叶片样本，使用双荧光素酶反应(DLR)试剂进行双荧光素酶测定。测定萤火虫荧光素酶活性后，在反应中加入40ulStopandGlowbuffer(Promega)灭活萤火虫荧光素酶，并启动REN荧光素酶(REN)反应，根据LUC/REN比值对转录活性进行分析，验证该报告系统的正确性。3结果分析3.1双荧光素酶报告子载体的构建用限制性内切酶KpnI和SpeI酶切合成的GAL4顺式元件序列GAL-UAS（图1A），得到的目的片段纯化后，用T4连接酶连接到报告载体pGreenII0800上，重组质粒的酶切鉴定产物如图1B中所示，片段大小符合预期，重组质粒经测序验证正确，说明质粒构建成功。 A M1 1 2 B M134201bp201bp 201bp图1pGreenII0800-GAL报告子载体构建A：GAL-UAS双酶切；B：重组质粒构建M1：DL2000marker；1，2：GAL-UAS双酶切产物；3，4：pGreenII0800-GAL酶切检测；Fig.2ConstructionoftheReporterpGreenII0800-GALA：DoubledigestionofGAL-UAS;B:ConstructionofrecombinantplasmidM1：DL2000marker；1,2:DoubledigestionproductofGAL-UAS;3,4:IdentificationofpGreenII0800-GALbyrestrictionenzymesdigestion;3.2效应子载体的构建从pGBKT7载体上克隆GAL4-BD(如图2A)，得到的目的片段纯化后，用限制性内切酶KpnI和AscI进行双酶切，再用T4连接酶连接到效应载体pMDC43上，重组质粒的酶切鉴定产物如图2B中所示，片段大小符合预期，重组质粒经测序验证正确，说明质粒构建成功。A BM112M1345 442bp 442bp图2pMDC43-GAL4/BD效应子载体构建A：GAL4-BD扩增；B：重组质粒构建M1：DL2000marker；1，2：GAL4-BDPCR产物；3，4：pMDC43-GAL4/BD酶切检测；5：pMDC43空载体酶切Fig.2ConstructionoftheEffectorpMDC43-GAL4/BDA:PCRamplificationofGAL4-BD;B:ConstructionofrecombinantplasmidM1:DL2000marker;1,2:PCRproductofGAL4-BD;3,4:IdentificationofpMDC43-GAL4/BDbyrestrictionenzymesdigestion;5:IdentificationofthevectorpMDC43.3转录因子OsMADS57和OsDRAP1转录活性分析 为了验证转录因子转录活性系统的正确性，我们结合拟南芥原生质体中建立的GAL4DNA结合结构域(GAL4-BD)和GAL4BD结合位点[GAL4(4X)-D1-3(4X)-GUS]的瞬时表达系统(Tiwarietal.,2001;)：将OsMADS57和OsDRAP1编码序列全长（图3A）分别融合到GAL4BD载体(在35S启动子的控制下)，以GAL4BD-OsMADS57和GAL4BD-OsDRAP1为驱动因子，以4个拷贝的GAL4DNA结合位点[GAL4(4x)-D1-3(4x)]驱动的荧光素酶(luciferase,LUC)基因为作为报告基因（图3B）。与对照（注射报告菌株和空载体）相比，烟草中同时注射OsMADS57效应菌株和报告菌株得到更低的LUC/REN比率，表明OsMADS57具转录抑制活性；而注射OsDRAP1效应菌株和报告菌株得到更高的LUC/REN比率（图3C），表明OsDRAP1具转录激活活性。A M112 BOsMADS57OsDRAP1 OsMADS57OsDRAP1C

图3OsDRAP1和OsMADS57转录活性分析A：OsDRAP1和OsMADS57基因扩增；B：效应子载体和报告子载体结构示意图M1：DL2000marker；1，2：OsDRAP1和OsMADS57PCR产物；Fig.3TranscriptionalactivityanalysisofOsDRAP1andOsMADS57(A)PCRamplificationofOsDRAP1andOsMADS57;(B)Theschematicdiagramshowstheconstructsusedinthetranscriptionalactivityanalysisassay;(C)TheratioofLUCandREN.4讨论转录因子通过转录激活或转录抑制对目的基因发挥调控作用，然而，目前对于相关转录因子的转录活性分析仅有转录激活分析(酵母激活体系)，且较为麻烦，不仅需要单独设置内参，还要排除假阳性；重复性差，只能定性，不能做到定量分析。而对于转录因子抑制活性的研究更是缺乏通用的技术体系。本文通过构建携带GAL4顺式元件G(AL-UAS)(Brametal.,1985;Elliottetal.,2008)双荧光素酶报告子载体和GAL4BD融合表达目的转录因子(已知具有转录抑制活性的OsMADS57和转录激活活性的OsDRAP1)的效应子载体，采用农杆菌介导的烟草瞬时转化体系对该系统进行验证，对比三种检测方法，结果均显示OsMADS57具有转录抑制活性，而OsDRAP1具有转录激活活性，表明该系统具有较好的转录活性检测能力。因此，笔者针对过去的不足，所开发的植物转录因子活性分析系统不仅具有快速、准确、灵敏度高等优点；同时，本文构建的双荧光素报告系统，不用单独设置内参，解决了内参问题。是一套具有广泛通用性的转录活性分析技术体系，可为候选基因(转录因子)生物学功能的深入挖掘及其转录调节机制的研究提供技术支撑。5结论参考文献黄立钰.水稻抗逆候选基因OsPDCD5和OsbHLH59的功能分析[D].中国农业科学院,2010.王传琦,孔稳稳,李晶.植物转录因子最新研究方法[J].生物技术通讯,2013,24(01):118-123.宿明星,孙颖颢,施鹤,李秋莉.植物非生物胁迫相关转录因子研究方法[J].生物技术通报,2015,31(01):51-60.樊松乐,王纪坤,覃碧,王立丰.植物转录因子研究方法及应用[J].分子植物育种,2019,17(15):5003-5009.李娟,高凯,安新民.转录因子NF-Y在植物生长发育和逆境胁迫响应中的作用[J].中国细胞生物学学报,2019,41(12):2434-2442.张丹,马玉花.NAC转录因子在植物响应非生物胁迫中的作用[J].生物技术通报,2019,35(12):144-151.刘燕敏,周海燕,王康,闫洪朗,徐建平,吴俊平,魏小云,何林池.植物对非生物胁迫的响应机制研究[J].安徽农业科学,2018,46(16):35-37+62.杨映雪.非生物胁迫对植物的影响及植物的抵抗机制[J].生物技术世界,2013(09):34.刘强,张贵友,陈受宜.植物转录因子的结构与调控作用[J].科学通报,2000(14):1465-1474.刘相莲,乔芳,黄德玉,袁宗辉,王旭.转录因子研究方法进展[J].生理科学进展,2017,48(01):73-76.张慧珍,白雪芹,曾幼玲.植物NAC转录因子的生物学功能[J].植物生理学报,2019,55(07):915-924.王芳,孙立娇,赵晓宇,王婕婉,宋兴舜.植物NAC转录因子的研究进展[J].生物技术通报,2019,35(04):88-93.AtchleyWR,FitchWM.Anaturalclassificationofthebasichelix-loop-helixclassoftranscriptionfactors[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,94:5172-5176.AmoutziasGD,RobertsonDL,OliverSG,etal..Convergentevolutionofgenenetworksbysingle-geneduplicationsinhighereukaryotes[J].EMBORep.,2004,5:274-279.StevensJD,RoalsonEH,SkinnerMK.Phylogeneticandexpressionanalysisofthebasichelix-loop-helixtranscriptionfactorgenefamily:genomicapproachtocellulardifferentiation[J].Differentiation,2008,76:1006-1022.PiresN,DolanL.Originanddiversificationofbasic-helix-loop-helixproteinsinplants[J].Mol.Biol.Evol.,2010,27:862-874.冯盼盼,陈鹏,洪文杰,等.拟南芥MYB转录因子家族研究进展[J].生命科学研究,2016,20(6):555-560.LipsickJ.S.,1996,OnebillionyearsofMYB,Oncogene,13(2):223-235.OgataK.,MorikawaS.,NakamuraH.,HojoH.,YoshimuraS.,ZhangR.H.,AimotoS.,AmetaniY.,HirataZ.,SaraiA.,IshiiS.,andNishimuraY.,1995,ComparisonofthefreeandDNA-complexedformsoftheDNA-bindingdomainfromc-Myb,Nat.Struct.Biol.,2(4):309-320.Ohme-TakagiM,ShinshiH.Ethylene-inducibleDNAbindingproteinsthatinteractwithanethylene-responsiveelement[J].PlantCell,1995,7(2):173-182.SakumaY,LiuQ,DubouzetJG,etal.DNA-bindingspecificityoftheERF/AP2domainofArabidopsisDREBs,transcriptionfactorsinvolvedindehydration-andcold-induciblegeneexpression[J].BiochemBiophysResCommun,2002,290:998-1009.NakanoT,SuzukiK,FujimuraT,etal.Genome-wideanalysisoftheERFgenefamilyinArabidopsisandrice[J].PlantPhysiol,2006,140(2):411-432.崔红军,魏玉清.酵母双杂交系统及其应用研究进展[J].安徽农业科学,2015,43(13):45-47.FieldsS,SONGO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteraction[J].Nature,1989,340(6230):245-246.LIJJ,HERSKOWITZI.IsolationofORC6,acomponentoftheyeastoriginrecognitioncomplexbyaone-hybridsystem[J].Science,1993,262:1870-1874.BramR.J.andKornbergR.D.SpecificproteinbindingtofarupstreamactivatingsequencesinpolymeraseIIpromoters.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1985,82(1).ElliottD.A.andBrandA.H.TheGAL4System.MethodsinMolecularBiology,2008,420:79-95.LiuZ.B.,UlmasovT.,ShiX.,HagenG.,andGuilfoyleT.J.ThesoybeanGH3promotercontainsmultipleauxin-inducibleelements.PlantCell1994,6:645-657.VasheeS.,XuH.,JohnstonS.A.andKodadekT.Howdo"Zn2cys6"proteinsdistinguishbetweensimilarupstreamactivationsites?ComparisonoftheDNA-bindingspecificityoftheGAL4proteininvitroandinvivo.[J].TheJournalofbiologicalchemistry,1993,268(33):24699-24706.UlmasovT.,LiuZ.-B.,HagenG.,andGuilfoyleT.J.Compositestructureofauxinresponseelements.PlantCell,1995,7:1611-1623.SkuzeskiJ.M.,NicholsL.M.,andGestelandR.F.Analysisofleakyviraltranslationterminationcodonsinvivobytransientexpressionofimproved-glucuronidasevectors.PlantMolecularBiology,1990,15:5-69.CurtisM.D.,andGrossniklausU.AGatewayCloningVectorSetforHigh-ThroughputFunctionalAnalysisofGenesinPlanta.PlantPhysiology,2003,133:462-469.TiwariS.B.,WangX.,HagenG.,andGuilfoyleT.J.AUX/IAAProteinsAreActiveRepressors,andTheirStabilityandActivityAreModulatedbyAuxin.ThePlantCell,2001,13(12):2809-2822.ChenQ.J.,ZhouH.M.,ChenJ.,WangX.C.UsingamodifiedTAcloningmethodtocreateentryclones.AnalyticalBiochemistry,2006,358(1):120-125.

电脑无法识别U盘该怎么办HYPERLINK电脑无法识别U盘怎么办?打开我的电脑上单击右键，在快捷菜单里，选择“管理”，打开“计算机管理”窗口。在计算机管理窗口里，选择“存储”下面的“磁盘管理”，如果看得到没有盘符的U盘，那么在这个U盘上按鼠标右键，选择“更改驱动器名称和路径”选项，就打开了“更改……的驱动器号和路径”对话框。再点击“更改”按钮，打开“更改驱动器号和路径”的对话框，在“指定以下驱动器号”的右边下拉列表里，选择你希望分配给U盘的驱动器号，尽可能靠后选择，比如X、Y、Z，选择好后，单击确定按钮，回到上一次“更改……的驱动器号和路径”对话框窗口，再一次单击确定，就回到“计算机管理”窗口。至此，如果一切正常，就给U盘单独设置了一个长久使用的驱动器号，并却，不受虚拟驱动器的影响了。建议将U盘插到电脑上，看任务栏中是否显示图标，如果显示，在我的电脑点右键查看属性——高级——硬件——设备管理器——查看里面是否有问号的设备，在问号设备上点右键——更新驱动程序然后下一步——否暂时不连接到网络——下一步自动安装软件（推荐）就可以了另外：系统不认U盘的几种处理方法1.禁用主板usb设备。管理员在CMOS设置里将USB设备禁用，并且设置BIOS密码，这样U盘插到电脑上以后，电脑也不会识别。这种方法有它的局限性，就是不仅禁用了U盘，同时也禁用了其他的usb设备，比如usb鼠标，usb光驱等。所以这种方法管理员一般不会用，除非这台电脑非常重要，值得他舍弃掉整个usb总线的功能。但是这种屏蔽也可以破解，即便设置了密码。整个BIOS设置都存放在CMOS芯片里，而COMS的记忆作用是靠主板上的一个电容供电的。电容的电来源于主板电池，所以，只要把主板电池卸下来，用一根导线将原来装电池的地方正负极短接，瞬间就能清空整个CMOS设置，包括BIOS的密码。随后只需安回电池，自己重新设置一下CMOS，就可以使用usb设备了。（当然，这需要打开机箱，一般众目睽睽之下不大适用~~）2.修改注册表项，禁用usb移动存储设备。打开注册表文件，依次展开"HKEY_LOCAL_MACHINE\SYSTEM\CurrentControlSet\Services\usbehci”双击右面的“Start”键，把编辑窗口中的“数值数据”改为“4”，把基数选择为“十六进制”就可以了。改好后注销一下就可以看见效果了。为了防止别人用相同的方法来破解，我们可以删除或者改名注册表编辑器程序。提示：“Start”这个键是USB设备的工作开关，默认设置为“3”表示手动，“2”是表示自动，“4”是表示停用。3.在computermanagement里将removablestorage的使用权限禁止。computermanagement是一个windows管理组件，可以在控制面板——管理工具——计算机管理打开。在该工具窗口中storage——removablestorage——property中，general项，可以控制系统托盘是否显示security则可以管理移动存储设备的使用权限。在security中将普通用户的使用权限降低，就可以达到禁用u盘的目的。破解的方法也很简单，管理员降低普通用户移动存储设备的使用权限，但未必禁用computermanagement的使用权限。普通用户可以通过这个工具解除usb移动存储设备的使用权限限制。另外，值得一提的是，如果u盘插到电脑上后可以驱动，但是我的电脑里却没有盘符，很有可能是管理员改动了u盘的默认盘符，使得我的电脑不能识别。这种情况，可以在movablestorage中看到u盘驱动器。可以在u盘驱动器属性设置里为u盘重新分配一个盘符，再重新插拔一次u盘，就可以在我的电脑里看到u盘的盘符了。一、首先可以将该U盘换到别的机器上，看使用是否正常。如果排除了硬件损坏的可能，一般就是软件方面有问题。在WindowsXP+SP1操作系统下，有些USB2.0设备的确常常出现工作不稳定的问题，可以试试安装设备自带的USB2.0驱动程序。另外最好不要使用USB延长线，防止因为供电不足而造成不稳定现象。如果仍无效，可以在主板BIOS设定中，将USB接口强行设置为USB1.1传输速率。二、（适用于WIN98）启动计算机，进入主板BIOS设置，检查BIOS中USB的相关选项是否已经打开：OnChipUSB设定为Enabled；USBController设定为Enabled；PNPOSInstalled设定为Yes；AssignIRQForUSB设成Enabled。要正常使用USB设备首先要开启USB接口，在主板BIOS里可以进行此项工作，一般来说只需在BIOS中进入ChipsetFeatures设置，并将USBKeyborad/MouseLegacy选项设定为Enable，就能够保证在操作系统下使用USB键盘了。这些选项的作用是打开主板芯片组对USB设备的完全支持，为系统识别USB设备做准备工作。三、USB口接触不好处理办法：拔下，等十秒钟再插上USB口，使接触完好；五、闪存盘驱动程序没有安装完成(WIN98系统下)处理办法：鼠标点“我的电脑”，选择属性找到“通用串行总线”，删除其中的USBMASSSTORAGE项，再点击“刷新”，然后按照提示重新安装一次驱动程序。六、接其它USB设备(如扫描仪、打印机、数码相机)时可以正常使用，接优盘时闪指示灯不亮，不能够使用。1、检查优盘与电脑的联接是否正常，并换用其它USB接口测试。2、检查设备管理器，看是否出现”通用总线设备控制器”条目，如果没有，请将电脑主板BIOS中USB接口条目*激活(ENABLE)。3、如果电脑安装过其它类型USB设备，卸载该设备驱动程序，并首先安装优盘驱动程序。4、到其它电脑试用此优盘，确认是否优盘不良。七、启动型优盘在的电脑上无法实现启动，可能是主板型号不支持。如何判断一块主板是否支持闪存盘启动系统启动型优盘是采用模拟USB软驱和USB硬盘的方式启动电脑的。只要电脑主板支持USB设备启动，即BIOS的启动选项中有USB-FDD、USB-HDD或是其它类似的选项，就可以使用启动型优盘启动电脑。八、第一次在电脑上使用优盘，未出现提示发现新硬件的窗口，驱动程序无法安装的原因可能是：1、主板usbcontroller未启用解决办法:在电脑主板BIOS中启用此功能。2、usbcontroller已经启用但运行不正常解决办法:在设备管理器中删除”通用串行控制器”下的相关设备并刷新。3、优盘被电脑识别异常，在设备管理器中表现为带有黄色？或！的”其它设备”或“未知设备”。解决办法:删除此设备并刷新。九、大容量的U盘(例如兼具MP3播放器或录音功能的U盘)或移动硬盘在电脑上无法正常使用，虽然系统提示找到了未知的USB设备，但无法正确识别U盘或移动硬盘。原因可能是：1．USB接口供电不足:系统为每个USB接口分配了500mA的最大输出电流，一般的U盘只需要100mA的工作电流，因此在使用过程中不会出现什么问题。大多数移动硬盘所使用的是普通的2.5英寸硬盘，其工作电流介于500mA~1000mA之间，此时假如仅仅通过USB接口供电，当系统中并无其他USB设备时，那么还是可以勉强使用的，但如果电压不稳的话，就随时可能出现供电不足的问题。特别是使用支持USB2.0的移动硬盘时，情况最为严重。另外，如果你的笔记本电脑使用电池供电，那么USB接口所分配的电量就更小了。2．使用了外接的USB扩展卡:在笔记本电脑中使用USB2.0的U盘或移动硬盘时，如果笔记本电脑不支持USB2.0技术，一般必须通过PCMCIA卡转USB2.0的扩展卡来间接实现支持，这些扩展卡基本上都采用NEC公司的D720100AGMUSB控制芯片，少则提供两个USB2.0接口，多则提供五个USB2.0接口，对一般用户而言足够使用了。由于PCMICA接口提供的电源功率比板载USB接口要小，这样就会由于供电不足而导致移动硬盘工作的出现问题。解决方案:1.它从USB连接线上接移动硬盘的一端引出一根转接线，可以插入电脑背后的PS/2接口取电，这里可以比USB接口提供更大的电流输出。2.利用电源补偿线(也称“键盘取电线”)，如果U盘或移动硬盘的包装盒中提供了选配的电源适配器，你就可以直接使用外接电源，这样就可以从根本上避免供电不足的情况发生了前置USB线接错。当主板上的USB线和机箱上的前置USB接口对应相接时把正负接反就会发生这类故障，这也是相当危险的，因为正负接反很可能会使得USB设备烧毁。所以尽量采用机箱后置的USB接口,也少用延长线.也可能是断口有问题,换个USB端口看下.USB接口电压不足。当把<ahref="mobileharddisk">移动硬盘</a>接在前置USB口上时就有可能发生系统无法识别出设备的故障。原因是<ahref="">移动硬盘</a>功率比较大要求电压相对比较严格，前置接口可能无法提供足够的电压，当然劣质的电源也可能会造成这个问题。解决方法是<ahref="">移动硬盘</a>不要接在前置USB接口上，更换劣质低功率的电源或尽量使用外接电源的硬盘盒，假如有条件的话。主板和系统的兼容性问题。呵呵这类故障中最著名的就是NF2主板与USB的兼容性问题。假如你是在NF2的主板上碰到这个问题的话，则可以先安装最新的nForce2专用USB2.0驱动和补丁、最新的主板补丁和操作系统补丁，还是不行的话尝试着刷新一下主板的BIOS一般都能解决。系统或BIOS问题。当你在BIOS或操作系统中禁用了USB时就会发生USB设备无法在系统中识别。解决方法是开启与USB设备相关的选项。就是开机按F2或DEL键,进入BIOS,把enableusbdevice选择enable。拔插要小心,读写时千万不可拔出,不然有可能烧毁芯片。XP中任务栏中多出USB设备的图标，打开该图标就会在列表中显示U盘设备，选择将该设备停用,然后你再拔出设备，这样会比较安全。

其实判断软件硬件问题很简单,在别的机器或换个系统试试就可以了.有些小的问题不妨先用专门软件格式化下.还有提醒大家WINDOWS下格式化时要选择FAT,不要选FAT32。

提示无法识别的USB设备维修

故障提示如图：

无法识别的USB设备：UnknownUSBDevice.很多人都遇到过的一个问题，所谓“无法识别”对于操作系统来说，或者是驱动程度有问题，或者是USB设备出现了问题，或者是计算机与USB设备连接出现了故障，解决问题的方法也是从这几处着手。

对于不同的设备会有不同的处理方法，了解USB设备正常工作需要的条件以及一些可能影响USB设备正常工作的因素，会有助于解决问题。

下面是保证USB设备可以正常工作的一些条件：（1）USB设备本身没有任何问题——可以通过在其它计算机上进行测试，保证能正常工作；（2）USB接口没有任何问题——可以通过连接其它的USB设备在此接口上进行测试；（3）USB设备的驱动程序已经正确安装，如果有详细说明书的USB设备，一定要仔细查看相应的说明文件，按照说明安装相应的驱动程序；Windows2000以后的操作系统以识别大部分的USB设备，Windows98以前的操作系统可以安装USB设备自带的驱动或者安装通用的USB设备驱动程序。下面是可能影响USB设备正常工作的一些情形：（1）USB设